新生儿疾病筛查的现状与展望

新生儿疾病筛查的现状与展望

摘要: 新生儿疾病筛查（Newborn screening, NBS）通过对一些危害严重的先天性疾病进行筛查，可早期诊治，从而避免或减轻疾病的危害。生化筛查技术是目前的主要筛查技术，但具有一定的假阳性及假阴性。酶活性检测技术的应用也为某些疾病提供了可靠的筛查方法。基因检测常用于NBS的二阶筛查及诊断。基因二代测序技术可实现一次实验检测数十种至数千种疾病的目的。随着该技术的成熟，新生儿基因筛查展现出良好的前景，但大规模应用于NBS仍面临巨大挑战。

关键词： 遗传病，基因检测，新生儿疾病筛查，二代测序技术，串联质谱检测

新生儿疾病筛查（newborn screening, NBS）是指在新生儿期通过对一些危害严重的遗传病进行群体性筛查，使患儿得到早期诊断和治疗，从而避免或减轻疾病危害，甚至死亡。NBS始于20世纪60年代对苯丙酮尿症（phenylketonuria, PKU）的筛查。1968年，在世界卫生组织的支持下，Wilson和Jungner 制定了评估潜在筛查计划作为公共卫生干预措施价值的标准，部分标准医学技术的发展和筛查情况进行了修改和完善。随后, 各地在Wilson和Jungner标准基础上，根据实际情况增加筛查病种。随着筛查工作的深入和对疾病的认知，20世纪90年代，串联质谱技术（tandem mass spectrometry，MS/MS）应用到NBS领域中，实现了一次实验同时检测多种遗传代谢病（inherited metabolic disorders，IMDs），极大地提高了筛查效率并使筛查病种迅猛增加。酶活性检测技术的应用也为某些疾病提供了可靠的筛查方法。近年来，二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）快速发展，其可同时检测数千种疾病，在NBS领域中展现出良好的应用前景，但仍面临诸多挑战。

2基于特异代谢物检测的NBS

2.1 单病种筛查

1963年, 美国Guthrie教授首先发明了细菌抑制法检测苯丙氨酸进行苯丙酮尿症（PKU）筛查，开创了NBS的历史。 1974年，Irie和Naruse采用干滤纸片放射免疫法进行先天性甲状腺功能减低症（congenital hypothyroidism，CH）筛查，获得了成功，从而以PKU和CH为主要疾病的NBS在欧美国家迅速普及。 以Wilson 和Jungner标准为指导，各地根据实际情况不断扩展疾病筛查范围。但传统的筛查方法一次实验仅能检测一种疾病, 至上世纪90年代，仅小部分疾病被纳入NBS项目中，主要包括半乳糖血症，先天性肾上腺皮质增生症，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症，枫糖尿病，同型半胱氨酸血症及囊性纤维化。 近年来，随着科技的快速发展、医学遗传学研究的不断深入以及治疗遗传病新药的研发, 使得筛查病种不断扩大。如新药的获批使得一些筛查研究中心开展新的检测方法以筛查杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）。该病是致死性的X连锁遗传性疾病，男性新生儿发病率约1/5000。DMD主要通过荧光法检测肌酸激酶活性，但具有较高的假阳性。2021年， Bao等采用时间分辨免疫荧光法检测肌酸激酶同工酶进行新生儿DMD筛查。共筛查10,252名男性新生儿，4例筛查阳性（肌酸激酶同工酶水平＞700ng/ml），2例经基因检测确诊，发病率为1/5216，证实了该方法的可行性。单病种筛查虽然有效，但一次实验仅能检测一种疾病，筛查效率低且具有较高的假阳性或假阴性。由于筛查结果易受胎龄、出生体重、采血时间及切值选择等因素影响，单病种筛查通常需要复查 。

2.2 多病种筛查

20世纪90年代, MS/MS技术的到来促进了NBS快速发展。目前, MS/MS技术可一次实验同时筛查氨基酸、有机酸及脂肪酸代谢异常等50余种IMDs，极大地提高了筛查效率。我国浙江省采用MS/MS技术对2009-2018年三百万名新生儿进行IMDs筛查，共筛查出28种疾病，整体发病率为1/4187。 此外，该研究还指出，基于MS/MS的NBS的增量成本效用比（incremental cost–utility ratio, ICUR）为-768,428.76元/质量调整寿命年（quality-adjusted life year, QALY），收益成本比为 6.09, 提示MS/MS应用于NBS具有较高的经济效益。 除IMDs外，目前MS/MS还可用于筛查其他疾病, 如先天性肾上腺皮质增生症, 重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID), 溶酶体贮积病(lysosomal storage disease, LSDs) 以及镰状细胞贫血等。 MS/MS的出现是NBS的一个里程碑, 但也存在一些不足: ①假阳性率高，筛查结果受胎龄、出生体重、营养、用药、地域/种族差异等多种因素的影响，易出现假阳性结果，从而造成产妇及家庭的焦虑;②筛查的部分疾病假阴性率高，如Citrin缺陷导致的新生儿肝内胆汁淤积症、多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症、鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症等疾病在新生儿期或未发病时代谢物通常无异常，导致出现漏诊的情况;③属于代谢物检测，不能确定基因型; ④筛查病种不够多，没有涵盖一些发病率较高的疾病，如成骨不全、黏多糖病、肝豆状核变性等。

3 酶活性检测

酶替代治疗的可行性使得部分LSDs被纳入NBS。Chamoles团队首次提出使用荧光法检测溶酶体酶活性。 该方法易于储存和转运且灵敏度高，被大多数实验室所采纳。康露露等人采用荧光法对80,855名新生儿进行戈谢病筛查，发现3例阳性，最终确诊1例戈谢病患儿。荧光法检测溶酶体酶活性的可行性已被证实，但是该方法不能同时测定多种酶活性。MS/MS检测方法因其灵敏度高、准确度好，且一次适用可同时检测数种溶酶体活性，更适用于开展高通量的新生儿LSDs筛查。2019年，美国纽约Wasserstein 等人开展了LSDs新生儿MS/MS筛查试点项目，共筛查了65,605名新生儿，成功检测出1例庞贝病，15例戈谢病和7例法布里病。 2020年, Chein等采用MS/MS技术对70,000名新生儿进行LSDs筛查，同时检测8种LSDs，包括黏多糖贮积症（Mucopolysaccharidosis，MPS）I 型、II型、3B型、4A型和 6型，庞贝病，法布里病和戈谢病，证实了MS/MS用于新生儿LSDs筛查的可行性。 此外，研究表明， MS/MS较荧光法更有效且准确度高。目前, LSDs 的筛查方法主要有MS/MS和荧光法, 但具有一定的假阳性。基因检测常用于进一步验证，此外对于克拉伯病、MPS I 型和 MPS II等疾病也可通过二阶生化标志物筛查以降低假阳性结果。

4 新生儿疾病基因筛查

近年来，基因测序技术快速发展，越来越广泛地应用于NBS领域中。基因测序可从分子水平明确诊断，识别生化检测不能确诊的疾病，从而为遗传咨询及优生优育提供依据。目前，用于单基因遗传病致病基因或致病位点明确的疾病基因检测的常用技术有Sanger测序，定量聚合酶链式反应技术（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）及高分辨率熔解技术。二代测序技术（next generation sequencing，NGS）又称为高通量测序技术，是一种大规模平行测序技术。根据测序覆盖范围的不同，基于NGS技术的高通量测序检测可分为基因包（Panel）检测、全外显子检测（whole-exome sequencing，WES）和全基因组检测（whole-genome sequencing，WGS）。NGS具有通量大、信息量丰富、灵敏度和精确度高等优点，可用于检测临床表现不典型、表型复杂、多基因致病或致病位点不明确的疾病。此外, 多重连接探针扩增技术主要用于基因大片段缺失所致疾病的检测如先天性肾上腺皮质增生症， DMD 及DiGeorge 综合征。

4.1 单病种基因筛查

4.1.1耳聋基因筛查

耳聋患者约70%是由遗传因素引起的。新生儿听力筛查虽然可以快速检查听力，但不适于迟发性、进行性或药物性耳聋筛查。2006年，Morton和Nance 首次提出对部分耳聋相关基因(GJB2, SLC26A4, and MT-RNR1)进行筛查，有助于提高迟发性语言耳聋的检出。 此后，耳聋基因筛查在许多地区广泛开展。 我国武汉地区利用对qPCR技术对142,417名新生儿进行了耳聋基因筛查，涉及耳聋基因包括GJB2, SLC26A4 和MT-RNR1，共有4289例（3.01%）新生儿发现至少携带一种突变，提示基因筛查有助于提高耳聋的检出率。

4.1.2 脊髓性肌萎缩症（Spinal muscular atrophy，SMA）筛查

SMA是一种常染色体隐性神经退行性疾病，发病率约为1/10000。约95%的患者是由于存活运动神经元(Survival motor neuron 1，SMN1)基因纯合缺失，导致SMN蛋白缺乏致病。由于基因治疗药物SPINRAZA (nusinersen)的获批，2018年SMA被纳入美国新生儿和儿童遗传病咨询委员会的推荐筛选Panel（recommended Uniform Screening Panel, RUSP）。 SMA没有特定的生化标记物，基因筛查SMA 的可行性已被证实。Chien 等采用实时PCR对台湾120,267名新生儿进行SMA基因筛查。15例患儿筛查阳性，最终确诊7例，其发病率为1/17,181。澳大利亚Kariyawasam 等采用相同的方法对103,903 名新生儿进行筛查，最终确诊9例SMA患儿，发病率为1/11,544。其中4例患儿在出生4周内出现肌张力低等症状。提示新生儿SMA基因筛查可在症状出现前检测出疾病，有助于提供早期干预治疗。

4.1.3 重症联合免疫缺陷症（Severe combined immunodeficiency，SCID）基因筛查

SCID是原发免疫缺陷病最严重的类型，为X-连锁或常染色体隐性遗传。采用qPCR法测定干血斑提取的DNA中T细胞受体切除环（T-cell receptor excision circles，TREC）含量，具有高度的敏感度和特异度，是目前新生儿SCID筛查的主要方法。自2008年美国率先利用TREC法筛查SCID起，许多国家如英国、法国、西班牙等都纷纷进行了SCID筛查研究。美国华盛顿曾对86,600名新生儿进行SCID基因筛查，并评估了筛查效益。该研究指出，与因家族史发现患儿相比，通过基因筛查发现SCID患儿每年增加1.19例，可避免0.40例死亡。ICUR估算每个生命年可节省35,000美元，收益-成本比为 5.31, 提示新生儿SCID基因筛查有助于提高生存率，且具有较好的经济效益。

此外，一些研究中心也开展了X连锁无丙种球蛋白血症、脆性X 综合征等疾病的基因筛查研究，但是单病种基因筛查一次仅能筛查一种疾病，筛查效率较低。

4.2 多病种基因筛查

NGS可实现一次实验同时检测数十至数千种疾病，极大地提高了筛查效率。 目前, NGS常作为NBS项目的二阶筛查，即对生化筛查阳性的患儿或可疑阳性患儿进行测序，以明确诊断，指导治疗和评估预后。2019年，我国江苏省开展了MS/MS 联合NGS筛查IMDs 研究。共筛查了536,008 名新生儿，经MS/MS初筛显示阳性1033例，进而对该1033例样本均召回采集外周血样本进行NGS检测，最终确诊194例IMD患儿，鉴定出23种IMD类型。该研究表明NGS可以弥补MS/MS技术的不足，有效降低假阳性结果。

近年来，随着技术的进步及应用价格的降低，一些研究中心在NBS项目中引入NGS，并将其作为一级筛查手段。Panel检测基因具有检测成本相对低，且具有针对性强、覆盖范围广、周转时间短等优势，但其无法发现一些未知基因和特殊变异。Campen等设计了一个包含ACADM 、PAH、TSHR、 CFTR和HBB的基因panel，以筛查PKU、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症、CH、囊性纤维化和镰刀型细胞贫血5种疾病，灵敏度和特异度分别为100%和99.96%。其报告时间仅1周，检测成本约71.14英镑/样。该研究证实了panel检测用于NBS的有效性且具有经济效益，但筛查的病种较少。Hao等成功设计了一个包含465种致病基因的panel，可检测596种遗传病。对中国八个省份11484名新生儿进行筛查，临床诊断率约0.95%。初步报告时间约11天，其中测序时间少于1周。 此外，该研究还指出了全国出生缺陷疾病谱和基因突变携带情况。Luo等也设计了一个包含573种基因的panel联合MS/MS对1127名新生儿进行筛查。其中，4例经生化诊断为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的患儿也获得了基因诊断，1例生化检测阴性的患儿，经NGS证实为原发性肉碱缺乏症。该研究还指出中国常见IMDs基因突变的携带率，其中前5位分别为PAH(1.79%)、ETFDH(1.23%)、MMACHC(1.15%)、SLC25A13(0.98%)和GCDH(0.80%)。

WES 和 WGS 因其覆盖区域广、可检出疾病新的致病基因或识别新的疾病等优势，现用于危重患儿的检测。但筛查病种的选择需考虑诸多因素，如发病年龄、疾病的严重性、 外显率、可治疗性、确诊方法和预后等。新生儿测序（BabySeq）项目纳入159名新生儿，其中127名为健康新生儿，32名为新生儿重症监护病房（neonatal intensive care unit, NICU）患儿。WES结果显示9.4%（15/159）新生儿有儿童期发病的风险（10名健康新生儿和5名NICU患儿）。在85名父母同意接受检测成人期发病风险的新生儿中，发现3名新生儿有成人期发病的致病变异。此外，88%新生儿至少携带一个儿童期发病的隐性致病基因，5%新生儿检测到药物基因组学变异。Willig 等比较了采用快速WGS（STATseq）和传统基因检测方法检测来自NICU和儿科重症监护病房（pediatric intensive care units, PICU）患儿遗传病的诊断率。结果显示，共有35例患儿进行了快速WGS检测，诊断率达57%（20/35），32例新生儿进行了传统基因检测，诊断率达9%（3/32），差异具有统计学意义（p=0.0002）。 目前，第二代STATseq项目可以在26小时内进行初步诊断，且灵敏度和特异度均超过99.5%，提示对于NICU和PICU 患儿， STATseq可作为一阶检测 。

NGS 可有效检测发病风险和基因突变携带情况，为遗传咨询提供依据。随着检测疾病范围的扩大，虽然成本和耗时等问题可能会被解决，但面临其他挑战。其中最主要的是对意义不明变异（variants of uncertain significance，VUS）的解释。VUS指的是基因检测中发现的未知或比较少见的变异，它们不能被归类为有已知危险性或者有利性的变异，从而对家庭带来困扰。 另一个挑战是应用基因组测序时对受检指征不相关但具有临床意义的次要发现的报告。尽管已有相关原则，但对次要发现报告的内容选择尚存在争议。 此外，在基因数据储存方面也引发许多问题，如存储内容的选择，存储和管理数据的高成本以及隐私泄露的潜在风险等。因此，尽管NGS在NBS项目中展现了良好的应用前景，但仍面临诸多挑战，其不太可能也不应该取代目前的筛查手段。

综上所述， NBS 是成功的公共卫生项目，其筛查病种在不断扩大。检测干血滤纸片特异代谢物的生化筛查技术在NBS中发挥了重要作用。基因检测和测序技术的快速发展使其成为NBS的强大工具。生化和基因筛查均有各自优势及不足之处。对于部分IMDs，采用生化筛查联合基因筛查方法将提高筛查效率，使患儿得到更早的诊断及治疗。