分子靶向药在儿童及青少年骨肉瘤临床治疗中的应用与前景

1、前言

随着精准医学的不断发展，分子靶向药的应用成为了目前的热门话题。遗憾的是，骨肉瘤没有类似于非小细胞肺癌那样源基因驱动的点突变，而更加特此性地标为染色体碎裂、全基因组复制(Whole Genome Doubling, WGD)导致的基因扩增和重排[1]。骨肉瘤具有复杂的基因不稳定性和高度的遗传异质性；同时可特征性地出现某些抑癌因子和癌基因的改变，包括p53、Rb、CDK4、MDM2和MYC[2]。虽然全外显子测序做了大量的研究，但是其实分析大多数局限于已知基因的变化，但是测序中的已知基因只占骨肉瘤测序基因中的15%左右，多数沉没于水中的基因还有很多待探索的空间[3]。同时，这些检测到的基因结构变异是否为用药的靶点有待进一步探索。由于单一药物不太可能导致明显的骨肉瘤退缩，因此临床常需联合用药[1]。几十年来，骨肉瘤的治疗一直集中在细胞毒性药物（化疗药）和细胞抑制性药物（靶向药）的开发，但常因存在肿瘤间或肿瘤内的异质性而导致令人失望的结果[1]。虽然免疫治疗可以诱导肿瘤的持久反应和改善预后，但在近年来的免疫节点抑制剂的临床试验中仅有少数个案的骨肉瘤患者获得了可持续的临床受益，且在整体人群中无统计学生存优势[1, 4, 5]。如何选择可能受益于免疫治疗的骨肉瘤亚群已成为迫切需要解决的问题。

2、儿童及青少年骨肉瘤基因型特点

2.1 骨肉瘤基因型的复杂性

骨肉瘤，尤其是青少年的骨肉瘤，特征性地存在复杂的核型。早年，Bridge JA等[6]的研究提示，骨肉瘤的基因型充斥着异倍体、反复的染色体断裂和重排。因此得出结论，骨肉瘤的基因型特征为染色体的异样断裂，且呈个体“指纹样”的差异。这是第一篇形容骨肉瘤的染色体断裂点并非随机，更多地出现在1, 2, 3, 4, 11, 12, 14, 16, 17, 19和22号染色体的特定区域。同时，杂合性缺失（loss of heterozygosity, LOH）在该疾病也极其重要，突出在17号染色体，肿瘤抑癌基因TP53的改变由此而来[7]。2023年的结缔组织肿瘤（Connective Tissue Oncology Society, CTOS）年会上, 由波士顿儿童医院牵头的全美12家儿童肿瘤建立的骨肉瘤基因测序数据库GAIN（Genomic Assessment Informs Novel Therapy）有报告了新的结果，人们把传统的关注于脱氧核糖核酸（DNA）的测序转向于核糖核酸（RNA）测序的结果，提出骨肉瘤大多数的结构变异（Structural Variation, SVs）是染色体碎裂事件的一部分，并不能用已知的机制来解释[8]。在同一肿瘤身上可以看到非常多的核型的多样性。而缺失-染色体易位-扩增（Loss-Translocation-Amplification, LTA）的染色体碎裂导致了相伴的TP53缺失，癌基因的扩征和WGD[8]。LTA是一种新的重排机制，解释了骨肉瘤复杂的基因型，且这种改变只出现于骨肉瘤，而在其他31种儿童癌症中不曾出现。在为数不多的描述骨肉瘤基因型的文献中（表1），高度提示以下抑癌和原癌基因的改变：CDK4/6，P53，MDM2，MYC，Rb等等[9, 10]。马丁等[11]提出骨肉瘤的主要染色体改变为3q, 6q, 9, 10,13和17p染色体的节段缺失和3q, 6q, 9, 10, 13和17p染色体的倍增，而6p染色体的获得通常涉及RUNX2, VEGFA, E2F3, PIM1和CCND3的改变，这些在骨肉瘤的成癌机制上均有研究。尽管如此，配对标本进行肿瘤进化过程的研究极少，关于骨肉瘤的成因，Negri及其同事通过深度测序13对骨肉瘤原发灶和转移灶的标本，提出随着系统治疗的推移，骨肉瘤的拷贝数高度保守，提示该肿瘤基因型不稳的概念可能需要更新[12]。而北大人民医院姬涛教授曾通过个案分析，提出骨肉瘤的三种不同的进化模式，并同临床治疗过程相关联，提示不同的进化模式的肿瘤学预后及对药物的反应不同[13]。北大人民医院汤小东教授曾使用15对骨肉瘤原发及转移配对标本进行进化模式的分析，结果显示非沉默突变的基因组图谱、肿瘤突变负荷在原发灶和配对转移灶之间无明显差异。进一步采用系统发育树与肿瘤系统发育分析显示了亚克隆进化模型（基于突变和拷贝数）和基于体细胞单核苷酸变异等位基因频率的多标本谱系树。骨肉瘤初始骨转移还是骨肉瘤初始肺转移均类似于大进化模式，即茎分支基因与主干基因整体差异较大，主要表现为未知的基因改变，原因不明，染色体碎裂和碎片较多[14]。

2.2 骨肉瘤常见的信号通路变异

通过对骨肉瘤标本的全基因组测序，MD Anderson率先进行了各类信号通路的归类和分析，提出骨肉瘤的基因型不稳定与各类信号通路是相关联的，也是骨肉瘤基因型的路标[15]。1）TP53 既往的外显子测序研究曾提示20-50%骨肉瘤病例存在TP53的改变，而且往往存在于1号内含子的改变中[7, 16]。然而，在陈等[17]的34名儿童骨肉瘤病人的全基因组测序中，55%的TP53基因型改变来源于结构变异。而36名来源于MD Anderson的骨肉瘤病人的标本中，仅有25%的病人存在TP53的结构变异[18]。TP53通路的缺失使细胞对DNA损伤基因型不稳，进而导致了骨肉瘤的发生。许多TP53缺失的细胞系产生了骨肉瘤，同时上文提到LTA也导致了TP53的改变，相辅相成[8]。2）Rb1和其他DNA损伤修复的信号通路 视网膜母细胞留转录公受体1（Retinoblastoma transcriptional corepressor 1, RB1），是控制细胞周期G/S转换过程中关键的调节因子，也是骨肉瘤基因型描述中较为常见的基因型改变。在不同的二代测序的基因型研究中，Rb1基因型的改变发生频率为50-78%不等，其主要作用为防止因为DNA损伤而细胞周期停滞，促进肿瘤发生发展[6, 7, 9, 14, 19]。在小鼠模型中不像TP53，单纯的Rb1改变不足以诱导骨肉瘤的产生，因而很多研究假设Rb1信号通路的改变协同了TP53的失活，进而导致了骨肉瘤的产生[20]。Behjati等[2]研究提示COSMIC基因印记5和8是骨肉瘤基因测序中最常见的印记，与预后差显著相关，与该信号通路相关。3）端粒延长信号通路 端粒可以保护细胞的染色体免于DNA损伤，在每次细胞分裂后染色质变得更短，最终导致细胞的衰老或凋亡。在骨肉瘤发生的过程中，经常出现端粒酶依赖的或不依赖的染色质延长机制，在细胞分裂持续进行，并使基因型不稳的细胞进化克隆的过程中加速细胞周期依赖的分离，避免端粒的缩短[21]。端粒基因的启动子突变，既往报道出现在4.3%的骨肉瘤标本中[22]。而非端粒酶依赖的机制，被称为更改的端粒延长机制，往往和ATRX失活有关，在MD Anderson骨肉瘤队列的检测中，ATRX导致的改变的发生率约20%，与TP53也有一定的联系[19, 23]。目前有关于端粒酶的ATR抑制剂，以及其他关于DNA损伤修复反应相关的抑制剂的临床试验正在进行的过程中[1]。4）胰岛素样生长因子受体通路/PI3K-mTOR通路 在MD Anderson的研究中20%的骨肉瘤样本存在胰岛素样生成因子受体通路的激活[2, 24]。另外，Perry等[18]发现，在胰岛素样生长因子的下游，PI3K或MAPK信号通路的激活也存在于27%的骨肉瘤标本中。进一步，该团队通过细胞系实验，验证了抑制该细胞信号通路可以抑制骨肉瘤的进展，为重要的靶标。在MD Anderson的测序分析中，涉及该通路的骨肉瘤占78%。在生物学标记物有限的情况下，使用胰岛素样生长因子受体的单抗、mTOR及PI3K的抑制剂也可能是骨肉瘤协同治疗的靶点[19]。

2.3 从基因的角度看骨肉瘤的免疫微环境

转录组分析（Transcriptome）来源于对大体RNA数据的整理以及其他方案来研究骨肉瘤与其免疫微环境的相互作用，近年来成为热门话题。但是，由于免疫检查点抑制剂的临床试验，例如SARC028中免疫应答者相比于无免疫应答者的比例悬殊，无法进行转录组学分析和比对，以发现有意义的转录组差异[4]。为了更好地理解骨肉瘤的免疫浸润浸润水平，MD Anderson比较了其他肿瘤亚型的TCGA（the Cancer Genome Atlas, TCGA）、87名TARGET数据库中骨肉瘤，以及一些零星的研究中的转录组学中免疫浸润评分，结果发现骨肉瘤患者的转录组学免疫浸润评分相比于其他肿瘤患者低得多；同时肿瘤浸润淋巴细胞CD8+与PD-L1/PD-1的染色相关[19]。GAIN的系列研究也发现骨肉瘤单细胞测序提示骨肉瘤个体间存在巨大的异质性，骨母细胞型、软骨母细胞型及纤维母细胞型等常见普通型骨肉瘤的免疫微环境中存在显著的免疫热度差异，以及表观遗传学调控的靶点[25]。

2.4 RECQ家族和基因不稳

Rothmund-Thomson综合症（RTS）是1868年被德国眼科医生Auguste Rothmund所描述，主要表现为皮肤一色症。直到1999年，该综合征才被发现RECQL4基因的突变[26]。目前所知，2/3的RTS存在RECQL4基因的突变（II型）而1/3的RTS存在ANAPC1基因的突变（I型）。既往的研究发现，病理性RECQL4突变与骨肉瘤致病相关，而RECQL4解旋酶主要起抑制骨肉瘤发生的作用[27]。因而RTS是研究骨肉瘤发生发展的天然模型。但是来源于RTS的骨肉瘤和散发的骨肉瘤模型不同，这类骨肉瘤倾向于发生于少见的骨的部位，且呈多中心发生的倾向。RECQL4基因在DNA损伤修复中的作用，临床医生往往在给这类病人常规一线化疗的过程中，需要因为粘膜炎症而进行剂量减量。高通量测序提示这类骨肉瘤可能存在肿瘤微卫星灶不稳（microsatellite instability, MSI）[28]。RECQL4诱导的骨肉瘤模型的细胞可能过表达RAD51，提示该类肿瘤可能可以采用端粒酶抑制剂联合免疫治疗来进行系统治疗[28]。

2.5 骨肉瘤的表观遗传学

表观遗传学的管控解除为肿瘤发生发展过程中重要的环节，主要表现为在染色体调控序列中通过组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases, HDACs）的乙酰化和去乙酰化，以及DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases, DNMTs）甲基化的修饰，进而导致下游通路转录表达是否正常进行，影响肿瘤的发生发展。在骨肉瘤中，Rb1和p53基因通路是超甲基化的，在DNMTs抑制剂治疗的过程中会过度表达[29]。因而骨肉瘤细胞系会被好几种DNMTs抑制，而被影响成骨样分化。溴结构域和外端基序蛋白抑制剂（the bromodomain and extra-terminal motif proteins，BETi）可可逆地作用域溴结构域，导致一系列的蛋白表达的重排[30]。2023年CTOS年会中，Katherine团队[25]从转录组学研究中区分普通型骨肉瘤3个亚型的差异，并进一步提出不同的表观遗传学靶点针对不同亚型的骨肉瘤有着不一样的控制作用，TMP195/269（经典的IIa型HDAC）抑制剂等。

3、目前多靶点靶向药物的应用

目前骨肉瘤的前瞻临床试验中，虽然没有源基因驱动的靶向药作为骨肉瘤治疗靶点的结果，但是，另外一类广谱的，抗血管生成（Anti-angiogenetic Tyrosine Kinase Inhibitors）的靶向药物却是明确可以延长进展期患者的疾病无进展生存期（见表2）[31-35]。但是，此后的临床研究发现，这类药物发挥作用主要依靠的是宏观上抑制肿瘤新生血管和供氧，肿瘤细胞膜表面的靶点的表达，例如VEGFR-2（血管内皮生长因子受体-2，Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2）、VEGFR-3、FGFR（成纤维细胞生长因子受体, Fibroblast Growth Factor Receptor）、PDGFR-β（血小板衍生生长因子受体, Platelet-Derived Growth Factor Receptor）等没有直接疗效的关系。进一步的临床试验发现，卡博替尼（cabozantinib）的前瞻的单臂研究中明显疾病无进展生存期长于其他类似的靶向药物，主要源自于其除了常规抑制剂靶点外，还抑制了MET、RET等靶点[34]。因而此后，这类靶向药物更多地被称为多靶点酪氨酸激酶的抑制剂（Multi-Target Tyrosine Kinase Inhibitors）更加确切。目前在儿童肿瘤协作组中，初治的骨肉瘤患者正在进行卡博替尼与一线化疗方案MAP的联用（详见图1），以期进一步改善初治骨肉瘤的疗效和长期预后。这类靶向药最大的问题是继发耐药，往往窗口期为4-6月，对瘤体负荷大、高度恶性（G3）且存在肺外转移病灶的患者，如何克服继发耐药是亟待解决的问题[5, 31-34]。基础研究显示这类多靶点抑制剂在强烈收缩供瘤血管，导致肿瘤乏氧而抑制肿瘤生长的同时，很容易破坏供瘤血管的血管内皮，进而导致微观上更多的肿瘤细胞进入循环系统，而进入循环系统中的肿瘤细胞更容易定值在这类多靶点靶向药血药浓度不高的部位，例如：脑、肝、骨、软组织等[36]。基于这样的前提，目前临床上使用这类靶向药联合化疗药物（化疗药物减量，小剂量的节拍化疗）可有效避免循环血液中肿瘤细胞定植于肺外病灶的情况。因此，联合用药的疾病无进展生存期较单纯靶向治疗可显著延长（表3）。但是，如何克服药物联用引发的更多毒副作用成为另一个亟待解决的问题。2022年末，郭卫教授召集全国专家进行了联合用药的毒副作用专家共识编写，对常见的联合用药问题进行了探讨和总结，也许可以解决一些临床上常见的问题[37]。

4、在研的源基因驱动的靶点

Paul S. Meltzer等[1]在2021年的新英格兰杂志发表了一篇关于骨肉瘤的综述，其中提到根据目前精准医学的理念，在骨肉瘤精准医学对应的可操作的靶点包括以下：1）基因拷贝数的畸变；2）基因的表达；3）DNA甲基化；4）肿瘤突变负荷；5）胚系DNA序列的遗传风险；6）多样化影像显影（例如多色免疫荧光染色之类的）。目前更多的源基因驱动的靶向药治疗着眼于骨肉瘤的DNA损伤修复及同源重组缺陷（Homologous Recombination Deficient, HRD），例如波士顿儿童医院牵头的PARP抑制剂联合ATR抑制剂作用于转移性或难治性骨肉瘤的临床试验。同时，MYC原癌基因的扩增，也与预后显著相关，曾经尝试进行表观遗传学Aurora A酶的抑制剂进行调控，但是临床试验结果不太理想，没有进一步探索[38]。抗体偶联的药物（Antibody Drug Conjugates, ADC）是一种新型的靶点药物，主要是根据多样化影像显影来检测，是一种新的治疗方向。目前在研的靶点有细胞表面蛋白LRRC15，IB期队列研究发现骨肉瘤及骨的多形性未分化肉瘤的客观缓解率均达20%，疗效持续的时间还需要进一步随访[39]。MD Anderson在研的ADC靶点MT1-MMP（BT1769）[40]。北京大学人民医院郭卫教授牵头的全国多中心临床试验HS-20093（针对B7-H3靶点）均有初步不错的临床疗效，进一步的生存学数据期待更长时间的随访。GAIN研究团队在对青少年普通型骨肉瘤进一步分型分析后，发现部分治疗靶点可能对特定的人群有一定的帮助，适合于单药或联合治疗，例如：Bardoxolone（REL/NFκB抑制剂）、Tegavivint（β-catenin/TBL1抑制剂）、Dinaciclib（CDK2/5/9抑制剂）、AZD1390（ATM/ATR抑制剂）、Valemetostat(EZH2/EZH1抑制剂)等[25]。

5、靶向药应用前景的思与辩

由于缺乏对骨肉瘤免疫微环境更多免疫靶点的认知，骨肉瘤遗传基因型的复杂性，病例数及样本量的缺陷等等，限制了对骨肉瘤新的治疗方式的开发，目前对骨肉瘤的精准治疗尚处于起步的阶段[11, 19]。一些多靶点、广谱的，以抗血管生成为主的治疗，虽然短期内可以抑制肿瘤的生长，但是并不改善患者的总生存期。而源基因驱动的靶向药的开发，在骨肉瘤并不像非小细胞肺癌那样成功，我们暂时无法发现“解药”来从本质上抑制肿瘤的发生和发展。但在现有的条件下，一些临床客观的认知，可以帮助我们更好地延长患者的生存期和改善生活质量。例如，在靶向治疗的过程中，巨大的瘤体负荷，大剂量的药物剂量，最容易引发继发耐药，那么适当通过局部治疗（手术或者放疗或者海扶刀）来减少瘤体负荷，以期使用“小剂量的靶向药来做最长时间的维持”，而避免病人生活质量因为药物治疗而受到影响，使得瘤体负荷最小，突出“维持治疗”的治疗效果。另外，针对瘤体负荷过大，存在肺内病灶及肺外病灶的进展期患者，靶向联合化疗无法时，化疗药物采用常规剂量的3/5，以期用“节拍化疗”的方式，避免过大的毒副作用和严重的骨髓抑制的发生，同时也起到了预防肺外病灶进展的可能[41]。抗体偶联药物的出现，让持久呈现为疾病稳定的骨肉瘤有了更多客观缓解，但是随之出现的继发耐药也是亟待解决的问题。如何有效地规避耐药，如何更好地进行药物联用，还有很多值得探索的地方。毕竟对不可切除的实体瘤来说，靶向药和化疗无法带来可持续的疗效，更好的排兵布阵，也许能让患者有更多生存学的受益。

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