肝细胞死亡的生物标志物

Akiko Eguchi , Alexander Wree , Ariel E. Feldstein . Biomarkers of liver cell death . Journal of Hepatology Volume 60, Issue 5, Pages 1063–1074, May 2014

王清图 译

摘要： 肝损伤时肝细胞细胞死亡传统认为发生于程序化的（凋亡）或意外、不受控制的细胞死亡（坏死）。从我们对参与细胞死亡的生化和分子机制越来越多的理解的证据提供了各种模式的细胞死亡的开阔视野，急性和慢性肝损伤期间能触发这些机制，比如坏死性凋亡（necroptosis）、细胞死亡（pyroptosis）、细胞自吞噬死亡（autophagic cell death）。在实验性动物模型或人体受特殊肝损害期间无创评价主要细胞死亡模型的复杂性在许多情况下所反映出的事实是不同的细胞死亡途径之间有显著地串扰和重叠。不过，细胞死亡期间受某一细胞内分子如蛋白质触发特异细胞死亡模型而实现，重新生成的碎片或MicroRNAs从肝细胞内释放入细胞外间隙并可能出现在循环中，由此刺激人们很有兴趣发展无创检测肝细胞死亡的标志物。本文综述一些最有前途的标志物，以及在评价人类肝损害的存在和严重性的潜在作用。

缩写词：NAFLD (非酒精性脂肪性肝病), NASH (非酒精性脂肪型肝炎), APAP (乙酰氨酚), ALI (急性肝损害), ALF (急性肝功能衰竭), ALD (酒精性肝病), CK18 (细胞角蛋白-18), FasL (Fas 配体), MMP (基质金属蛋白酶), sFas (可溶性 Fas), sFasL (可溶性 FasL), TNF-α (肿瘤性坏死因子-alpha), TNFR (肿瘤性坏死因子受体), sTNF-α (可溶性 TNF-α), sTNFR (可溶性TNFR), DISC (死亡诱导信号复合体), FADD (Fas-相关蛋白死亡域), TRAIL (TNF-相关的凋亡诱导配体), TRAIL-R (TRAIL 受体), DR (死亡受体), sTRAIL (可溶性TRAIL), sDR (可溶性DR), RAGE (高级聚糖晚期产物受体), TLR (toll-样受体), IRAK (白介素1受体相关激酶), miRNA (microRNA), HCV (丙肝病毒), HBV (乙肝病毒), MP (microparticle), ALT (丙氨酸转氨酶

肝细胞死亡模型在急性和慢性肝病的概念演变

越来越多的证据表明数个肝细胞细胞死亡的模式发生于急性和慢性肝病。的确，在急性和慢性病毒性肝炎、酒精性和非酒精性脂肪性肝炎（ASH和NASH）、以及药物性肝损伤（DILI）时过度细胞死亡已认定为肝损伤的中枢机制。持续的肝细胞细胞死亡也涉及肝纤维化的发展。认识和识别在肝脏病理生理学中参与生化瀑布导致细胞死亡的关键分子对各种肝病患者开发和测试新药和/或基因介导疗法提供了新的选择。

一般而言，每个细胞死亡途径根据初始事件、中间变化、晚期细胞活动和对组织的影响能区分开来。除了经典的细胞死亡模式如细胞凋亡和坏死（细胞胀亡）外，也已描述了其他形式的肝细胞死亡，包括自吞噬细胞死亡、细胞死亡和坏死性凋亡。细胞凋亡是一个高度有组织和基因控制的过程，是研究最多和定义最好的程序性细胞死亡形式。细胞凋亡是由膜受体（外在途经）或细胞内刺激（内源性途径）发起的。可是，这两条途径导致效应凋亡蛋白酶3和7活化，执行了最后的凋亡变化。是否自我吞噬功能启动或防止细胞死亡一直存有争议。自我吞噬被描述为与细胞凋亡和细胞坏死一道的一种细胞死亡类型。相比之下，许多研究定义了细胞自噬的保护功能。按照受体蛋白激酶1和3(RIP1 and RIP3)的相互作用，和没有激活半胱天冬酶8，形态学上细胞死亡类似于坏死发生。细胞死亡（Pyroptosis）是十年前Cookson 和Brannan首先报道以一种新型半胱天冬酶1依赖型为特征的程序性细胞死亡。炎性体（Inflammasome）依赖半胱天冬酶1激活启动（作用于40多个基质）炎症反应，促炎细胞因子pro-IL-1β and pro-IL-18经分裂活化。此外，半胱天冬酶1在细胞膜介导离散的离子渗透孔形成，导致水分内流，细胞肿胀，最后由于渗透压增大而细胞溶解。坏死或细胞胀亡（oncosis）是一种意外的细胞死亡形式的致命后果，细胞缺氧借以产生活性氧（ROS）导致线粒体功能紊乱和下降，ATP水平低于维持细胞完整性的阈值需要。形态学上细胞胀亡以细胞肿胀(‘oncosis’ in Greek)为特征，形成缺乏细胞器的膜泡，最后细胞膜破裂，释放出细胞内容物（表1）。

表1。肝细胞死亡的不同模式.

RIP1/3, receptor interacting protein（受体相互作用蛋白）1/3; mTOR, mammalian target of rapamycin（哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白）; Atg, autophagy-related（自噬相关）; ROS, reactive oxygen species（活性氧）.

大多数细胞死亡模型在体外原代肝细胞或几个永生化肝细胞细胞系有广泛的特点，但仅少数用各种实验动物活体（in vivo）或肝病患者得以良好定义。许多情况下，来自体内（ex vivo）（取自动物模型的肝组织或人的肝活检组织）或活体（模型生物和/或人）研究细胞死亡的复杂性来自于识别肝细胞死亡代表了一个高度异构的过程。而且，参与途径之间频繁地重叠和串扰可以导致不同形态之间的分子转换。同样的，程序性和非程序性细胞死亡之间的路线在肝脏等组织细胞死亡会变得模糊，吞噬细胞通常不会密切接触。因此在急性或慢性损害期间细胞经历特殊形式的细胞死亡会经历二次原位细胞溶解导致混合模式的细胞死亡。尽管有这些重大挑战，以机制为基础、非进入性细胞死亡标志物的发展前景得到显著地关注。这些标志物可以提供关于人类疾病病理生理学的新线索，可以帮助分类病人处于危险中，和/或用当前的诊断选择可能对特殊治疗（例如，半胱天冬酶抑制剂）有反应的病人。在随后的部分，我们将讨论细胞死亡一些有前途的和充分研究的血液标志物在各种肝病的意义，涉及它们用作非进入性工具检测肝损伤的潜能，在识别细胞死亡特异模式是它们的作用和局限性，以及以机制为基础的生物标志物对人类肝病将来的前景。

细胞内容物的细胞角蛋白-18（CK18）可溶部分，肝脏的主要中间丝蛋白，在体外和体内细胞死亡实验时显示释放入细胞外间隙，所以假设血液中测定到可溶性CK18对监视上皮凋亡细胞死亡是一种可行的方法。全长CK18能被半胱天冬酶-6和半胱天冬酶-3和-7裂解，造成分别大约30 kDa和45 kDa碎片。30 kDa片段可以检测用于特定抗体（M30）.而个别抗体（M65）检测全长和其他片段型（图1）。已有假设M30：M65比值能有效地区别细胞凋亡和坏死性细胞死亡。这一概念最近被争议的一些原因：(1)现在很清楚独立的半胱天冬酶激活能发生细胞凋亡，已有报告和许多半胱天冬酶激活在非致命性过程中的实例一样；(2)除坏死以外，许多细胞死亡模式与浆膜的破坏有关，浆膜破坏能导致释放CK18（例如：细胞死亡）；(3)来自复杂生物体的组织中，细胞经凋亡而死亡，或其他形式的细胞死亡，可能经受二次细胞溶解，其后释放CK18。最近，Kramer及其同事发表了一项优雅的研究，在体外肿瘤细胞系和凋亡前化疗暴露之后癌症患者体内血清评价M30：M65比值，他们的结果显示体外释放超过85%的CK18是由半胱天冬酶裂解CK18所组成，而体内M30：M65比值是低至0.01。作者推断凋亡前治疗，半胱天冬酶活化药物导致循环全长CK18（M65阳性）大量增加。

图1. 死亡配体/受体和CK18信号途径. 全长CK18被活性半胱天冬酶-3/6/7消化，全长和片段CK18释放入血管。死亡配体绑定死亡受体然后激活细胞死亡途径，导致细胞凋亡或者坏死。死亡复合物由FasL/Fas 和 FADD（Fas相关蛋白与死亡域）组成，通过下列途径触发凋亡：(I)激活半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-3，或者(II)激活凋亡前蛋白，如Bid和Bax，导致凋亡体复合物装配（细胞色素C，Apaf-1和 半胱天冬酶-9）并激活半胱天冬酶-3。死亡复合物由TNF-α/TNFR1、 TRADD (TNF-R相关死亡结构域)、TRAF2 (TNF受体相关因子2)、RIP1 (受体相互作用蛋白1)和clAP1组成，激活如下途径：(1) IKKβ, (2) c-Jun, (3) TRADD, FADD, 和RIP1 复合物，随后坏死, 或 (4) 激活半胱天冬酶-8, TRADD, FADD, 和RIP1 复合物，触发凋亡。

揭示增加肝细胞细胞死亡的价值，作为脂毒性损害的结果，在NASH的发生和发展中让我们想到：测定循环水平的可溶性CK18考虑量化肝细胞细胞死亡，因此无创诊断NASH。最近的荟萃分析在NAFLD患者中诊断NASH显示血浆CK18水平敏感性78%，特异性87%，接受者操作曲线下面积(AUROC) 0.82 (95% CI: 0.78–0.88)。在一项231例参与者的PIVENS (吡格列酮对比维生素E对比安慰剂治疗非酒精性脂肪型肝炎非糖尿病患者)实验显示，血清CK18每下降100-U/L与总体组织学改善、NASH缓解、脂肪变性评分至少改善1个点、肝细胞肿胀、和NAFLD活动评分（NAS）改善有相关性。研究者对231/247例登记进入PIVENS实验者测定了CK18基线和其后的16、48、96月CK18水平。此外，CK18是最近发布的AGA/AASLD/ACG诊断与治疗NAFLD指南中唯一的NASH生物标志物。推荐是“虽然血清/血浆CK18是识别脂肪性肝炎有希望的生物标志物，推荐在日常临床实践中应用尚不成熟。”(Strength--1, Evidence--B)

片段和全长CK18循环水平也显示在其他肝病时升高。Bantel及其同事广泛研究了慢性丙肝（CHC）患者肝细胞细胞死亡与CK18释放的关系，在59例慢性丙肝患者血清中发现CK18水平显著升高；超过50%的转氨酶水平正常CHC患者显示血清CK18水平升高，30%的血清转氨酶正常而CK18升高的患者显示纤维化晚期。肝活检标本肝脏脂肪变性程度量化与CHC患者血清CK18水平密切相关。与传统的代理标志物比较，测定CK18血清水平似乎对发现早期肝损伤和纤维化是更敏感的方法。血清CK18作为CHC临床标志物的有用性受到267例大样本初治CHC研究的质疑。Jazwinski等发现当与对照组比较时CHC患者CK18水平升高，而纤维化阶段与增加血清CK18水平与CK18和脂肪变性评分之间并无相关性。此外，Yilmaz等报道NASH患者比CHC感染患者有较高的CK18水平，作者推测与CHC患者比较，NASH患者通过细胞凋亡增大了肝细胞的损失。而这些研究支持CHC与增加循环CK18片段水平结合，这些生物标志物在CHC患者潜在的临床作用和潜在效用仍不确定。尤其，对临床决策有什么优势，或者对当前病毒载量测定的标准测量的潜在好处？这些标志物会用于评估脂肪变性或纤维化的严重性吗？进一步，在评估CHC肝纤维化时如何将这些测定与各种血清学的和影响形态相比较？

在慢性乙肝的许多文献中也评估了血清CK18片段。包括115例HbeAg阴性慢性乙肝研究中，血清CK18与血清转氨酶、病毒血症、和评分分数相关，而与纤维化和脂肪变性严重性无关。作者结论CK18片段水平对区别非活动性HBV携带者与HbeAg阴性慢性乙肝会是一种有用的标志物，但无助于评估HbeAg阴性慢性乙肝肝组织学损伤的严重性。

CK18总量是Mallory小体的主要成分，酒精性肝病的诊断标志，这使得CK18似乎是很有前途的生物标志物。的确，大量饮酒者血清CK18水平比健康对照组要高，酒精性肝炎病例血清CK18水平比脂肪肝病例要高。有趣的是，酗酒者尿液中全长CK18水平增高。Lavallard等最近的研究中评估143例严重酗酒者血清标本CK18和CK18片段，确证了以前以前研究所见的CK18和CK18片段与Mallory小体、肝细胞肿胀和肝纤维化强烈相关。血清肝细胞死亡和凋亡标志物水平升高在预测严重肝纤维化中是独立危险因素。作者结论CK18和CK18片段血清水平对酒精性肝病快速评估肝损伤和有效的治疗是有用的。

人类急性肝衰竭（ALF）的机制是复杂的，病因依赖的，被认为是受多种细胞死亡模式之间平衡的影响，主要是坏死和凋亡，以及细胞再生。因此，测量生物标志物可以帮助区别细胞死亡模式是极具吸引力的工具，可以帮助理解ALF的机制途径，起潜在预后指标的作用。一组68例ALF早期研究中，Bechmann等发现以测定M65判断非自发缓解与总CK18强相关。他们应用CK18（M65）为基础MELD（晚期肝病模型）评分取代胆红素与M65 在MELD评分计算；。他们能证明在预测ALF患者存活方面高敏感性和特异性。然而，由于研究患者例数少，缺乏验证队列，这种新的评分的准确性对不同病因的ALF不能评估。然而该研究提供了证据支持测量不同的CK18标志物能帮助区别不同类型的细胞死亡参与各种形式的ALF的概念。其后又急性肝衰竭研究组(ALFSG) 进行的最大规模研究总共包括500例ALF，证实预测病人需要肝移植或死亡方面M30（而不是M65）是更有效的测定方法。根据这些结果作者开发了ALFSG指数，包括昏迷程度、INR、胆红素和磷的水平、log10 M30值，而随后在另一组250例ALF患者验证了这些发现。

总之，CK18和 CK18-片段在各型急性和慢性肝损伤是升高的。已明确CK18片段在预测成人和儿童NAFLD肝活检存在NASH是最可靠的生物标志物。测定CK18片段作为ALFSG指标的一部分在ALF患者是更好地预测结果（语国王学院标准（KCC）和MELD计分比较）。但CK18测定仍是一项研究工具，临床上目前尚不可利用。这些标志物在诊断、监视各型肝病的作用仍不清楚，仍需进一步研究。

死亡受体及其配体

可溶性Fas受体与Fas配体

Fas (CD95/APO-1)是肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族中的一种死亡受体，在不同的组织中有表达，通过Fas配体(FasL/CD95L)被激活，是肿瘤坏死因子超基因家族的一员。已经绑定，受体接受三聚作用并形成细胞内死亡诱导信号复合物(DISC)。DISC包括Fas相关蛋白与死亡域(FADD)，触发I型或II型信号级联放大。在I型细胞中，亚氨基酸半胱天冬酶-8的裂解最终导致激活凋亡效应光门蛋白酶（半胱天冬酶-3, -6, and -7) ，而II型细胞凋亡体复合物从功能失调的线粒体释放（图1）。Fas/FasL信号途径已经涉及各种肝脏疾病，包括Wilson’s病、酒精性肝病、急性重症肝炎，以及慢性病毒性肝炎。Fas信号也已显示在肥胖相关脂肪肝与增大对肝损害的敏感性之间起了链接作用。最近的一份食源性肥胖动物模型和非酒精性脂肪性肝炎患者研究报告中，许许多多Fas受体显著增多，导致肝脏对内生Fas配体(FasL)敏感性增大。此外，Zou等的研究显示，在两个脂肪肝模型中用一种抑制肽(YLGA 12-mer)化学阻断Fas信号能逆转肝损害。

可溶性Fas (sFas)是膜相关Fas的可溶型，是由其他mRNA剪接而成。但可溶性Fas L(sFas)由膜结合FasLike通过金属基质蛋白酶(MMP)样酶转换而来。sFas 和 sFasL二者似乎是在血清中监视细胞死亡有趣的非侵入性生物标志物。Suzuki等发现在肝炎的急性期血清sFasL水平是增加的，不同的水平根据肝炎的原因而变化。另一研究中，Nakae等描述ALF患者较脓毒症患者sFasL水平显著升高；但未观察到sFas水平有显著差异。在NASH患者中最近证明在活检证实NASH患者比单纯脂肪变性患者血清sFas和sFasL显著升高，由此也生成一预测模型诊断NASH包括CK18和可溶性Fas，敏感性和特异性分别88%和89%。

可溶性TNF受体和TNF-α

肿瘤坏死因子-alpha (TNF-α)是一种单核细胞生成的细胞因子，已知与癌症的发展、严重感染性疾病和肝损伤有关联。为了实现组织中的炎症反应，TNF-α绑定到两个不同的受体：TNFR1 和TNFR2，TNFR1 几乎在所有的组织能表达， TNFR2仅在炎性细胞表达。一旦TNF-α绑定 TNFR1，TNF受体相关蛋白与死亡域(TRADD)被招募到TNFR1死亡域。TRADD在TNF信号级联中是一个主要分子，至少能激活三个不同的和可能自行矛盾的信号级联：(1) I-kappa B 激酶 (IKK) 复合物，诱导炎症前和抗凋亡靶基因； (2) c-Jun激酶引起凋亡前和增殖相关基因增加；(3) 死亡诱导信号复合体 (DISC) 引起凋亡（图1）。

已知炎症介质如细胞因子和脂肪细胞生成称为脂肪因子（adipokines）的细胞因子在确立NAFLD和发展到脂肪性肝病更高阶段过程中起了重要作用。TNF-α作为促炎症介质在胰岛素抵抗中的作用，NAFLD发展的关键因素在近二十年前由Hotamisligil首先发现。肥胖动物用中和抗体改善胰岛素抵抗治疗，显示TNF-α在脂肪细胞超表达；尤其NASH患者比单纯脂肪变性患者肝脏TNF-α 和 TNFR1 mRNA水平增高。该研究发现NASH和ASH患者的肝细胞凋亡也显著增加。TNF-α转换酶(TACE) 裂解受体绑定TNF-α和膜结合 TNFR1 或TNFR2，致使可溶性TNF-α (sTNF-α) 和 可溶性TNFR1 或TNFR2 (sTNFR1 或sTNFR2) 释放入血流。因此，sTNF-α 和sTNFR显示对监视细胞死亡作为非侵入性生物标志物是有趣的目标。McClain等最近的报告描述TNF-α在ASH是代谢失调，并报告培养AH患者单核细胞自发产生TNF-α。许多其他研究证实ASH患者增加血清TNF-α浓度与疾病严重程度和死亡率相关。Felver等报告在严重ASH患者入院时或者在出院30天后血浆TNF-α浓度升高，ASH患者发现82%死亡率，而没有血浆TNF-α水平升高患者100%存活。Bird等报告严重ASH患者其后死亡者血浆TNF-α水平高于幸存者，作者也发现TNF-α水平与血清胆红素和肌酸酐值显著相关。此外，在儿童、青少年和成人NASH均有血清TNF-α含量增加。慢性HC、肝硬化和肝细胞癌比急性或轻度慢性HC患者血浆TNF-α显著升高。有报道称在慢性HC患者可溶性TNFR1和 可溶性TNFR2与疾病进展正相关。

可溶性TRAIL受体与TRAIL

TNF受体家族进一步结合TNF相关凋亡诱导配体受体(TRAIL-R), TRAIL-RI, 和TRAIL-RII，最后两个也被称为死亡受体4(DH4) 和 DH5。已经假设TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)能引起凋亡，因为它激活半胱天冬酶，很大程度上类似于参与Fas和TNF-α诱导细胞死亡（图1）。TRAIL和DH4与DH5一样参与多种疾病，包括血管疾病、癌症和感染性疾病。所有三种TNF受体在HCV相关慢性肝损害和肝硬化患者以及HB介导ALF患者肝脏标本中均显示呈上调节。Malhi 和Kahraman等两项研究显示NASH患者的肝脏中增强DR5表达。而且，血清sTRAIL水平显示在NAFLD或者HBV感染患者与健康对照组比较显著升高。

基于这些研究结果，死亡受体如TNFR和TRAIL-R以及它们各自的配体认为是有希望的监视肝损害的非侵入性生物标志物。

高迁移率族蛋白B(HMGB1)

高迁移率族蛋白B(HMGB1)也称作高迁移率族1（HMG-1）和二性霉素B（amphoterin），是一种在几乎所有真核细胞表达的高度保守、大量、非组蛋白核蛋白。HMGB1的细胞影响是通过信号途径诱导受体，如高级多糖受体最终产品（RAGE ）和toll样受体4(TLR4)。这两种受体激活NF-κB，而RAGE介导这种激活通过Ras/p38 或CDC42/Rac1、 TLR4 招募 MyD88，然后形成一种包含TRAF6、白介素1受体相关激酶1 (IRAK1)和IRAK4的复合物。在核内，HMGB1调节和“使液化核小体，弯曲DNA和结合弯曲染色质DNA，因此，促进许多基因转录（图2）。作为先天免疫系统的一部分，HMGB1蛋白起一个共同信号通知宿主细胞应激、计划外细胞死亡和微生物入侵的作用。在炎性刺激的应答过程中，包括巨噬细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞和成熟树突细胞均可以分泌 HMGB1；最初认为它仅有坏死细胞而不是凋亡细胞释放，最近的研究表明，经过细胞凋亡途径的细胞死亡也能释放HMGB1。在许多人类肿瘤细胞系化学治疗诱导细胞死亡（星孢菌素、依托泊苷或喜树碱）随后释放HMGB1，这种释放经过应用细胞凋亡抑制剂Z-VAD-fmk可以被减弱。因此，从凋亡和坏死两种细胞释放HMGB1能观察到。分布和核运输影响HMGB1分泌受受到几个翻译后修饰如乙酰化、半胱氨酸氧化和磷酸化作用的控制。HMGB1在单核细胞和巨噬细胞是过度乙酰化与LPS激活，而经坏死或病损细胞释放的被认为是非乙酰化的HMGB1。最近，Lamkanfi等描述了在NLRP3炎性体装配和半胱天冬酶1激活期间HMGB1释放的依赖性，他们发现从LPS致敏巨噬细胞或者鼠伤寒沙门氏菌感染巨噬细胞分泌HMGB1需要炎性体成分，例如，分别为凋亡相关小颗粒样蛋白包含半胱天冬酶激活和招募域（ASC）、半胱天冬酶1和Nalp3、或半胱天冬酶1和Ipaf。Lu等气候的研究显示炎性体激活依赖双股RNA依赖蛋白激酶(PKR, 也称为 EIF2AK2)。

图2. HMGB1的信号通路. HMGB1结合到TLR（Toll样受体）4并招募MyD88，随后NF-κB经TRAF6（TNF受体相关因子）、IRAK1（白介素1受体相关激酶1）和IRAK4激活。HMGB1也结合到RAGE（高级多糖终末产物受体），导致NF-κB经CDC42/Rac1或 Ras/p38活化作用而激活。HMGB1乙酰化作用是由NF-kB、 MAPKM和NFA在细胞核介导的，释放入血管与由PKR激活驱使炎性体活化有关联。

HMGB1产生在ALF期间的作用在各种实验模型中不断探讨。Kamo等在部分肺叶肝脏热缺血小鼠模型试验显示，ASC介导半胱天冬酶1/IL-1β信号促进HMGB1产生TLR4依赖炎性表型导致肝细胞损害。另一研究在Concavalin A (Con A)急性肝衰竭期间处理细胞内HMGB1在介导早期Kupffer细胞(KCs)的激活作用，作者发现HMGB1表达上调和HMGB1在KCs的迁移与早期KCs激活相一致，而细胞内HMGB1的阻断显著抑制促炎性细胞因子的生产。

根据HMGB1在急性肝损伤期间肝损害发病机制中的重要性，概念上这种分子（超乙酰化对总的）的不同形式能有助于区别不同模式的细胞死亡。Park等检查了对乙酰氨基酚(APAP)诱导急性肝损伤时作为肝细胞死亡生物标志物的作用，证明在一个小实验研究中总的和超乙酰化HMGB1水平在血清APAP过量肝损伤患者比过量但无肝损伤患者和健康受试者升高。增加总的和超乙酰化HMGB1与不良预后(King’s College Criteria)有关，病人死亡或者需要肝移植（当与自然痊愈这比较时）。在同一组的后续研究中，总共129例对乙酰氨基酚诱导急性肝损伤患者血液中总HMGB1水平评估是在首次给药时去医院，过量给药8小时内识别急性肝损伤时发现总HMGB1浓度好于血清ALT水平。经独立组进一步研究正是这些结果，和评估HMGB1在非APAP急性肝损害形式的效用一样，是需要的。可惜迄今为止没有鉴定HMGB1不同功能亚型的特异抗体，质谱分析法为基础的分析目前是鉴别的唯一选项。这些方法有其局限性，包括重现性问题、操作者依赖要求熟练、训练有素的分析师和专门的蛋白质组学实验室、以及低产出高消费，目前限制了其在临床医学中的作用。

微小核糖核酸（miRNAs）

已知微小核糖核酸(miRNA)是一小的非编码RNAs21-25核苷酸，在基因表达的调控上起重要作用。它们生成一前体（pre-miRNA）并从核出口。在细胞质中，pre-miRNAs经由称作Dicer的内切核糖核酸酶识别，后者是核糖核酸酶III（RNase III）家族成员，裂解为21-25碱基对长miRNAs。Dicer也打开裂解部分到单股，加载miRNA进入RNA诱导沉默复合物(RISC)。miRNA-RISC复合物会与目标基因的信使RNA的3′末端非翻译区(3′UTR)相互作用，致使抑制mRNA翻译。miRNA-RISC复合物也能直接绑定到靶序列使mRNA降解(图3)。因为单一miRNA可以有几个目标基因，在基因调控上它起了重要作用。的确，许多miRNAs参与了各种疾病过程，尤其癌症；miRNAs已经起了生物标志物的作用。miRNAs也提供了有趣的治疗靶点机会。几个miRNAs在肝脏明显的表达或强化。大多数丰富肝脏特异性miRNAs是miR-122，存在于肝细胞，在肝细胞损害期间释放入循环中。Wang等和Su等两项独立的研究在实验性小鼠模型识别miR-122和miR-192作为潜在的生物标志物探寻了对乙酰氨基酚(APAP)的毒性。研究显示这些miRNAs血液水平的剂量和时间依赖变化与肝损害的组织病理学改变相平行。这些miRNAs血浆水平的改变在APAP暴露后早期会检测到，是肝损害评估中比ALT测定更敏感的指标。根据这些结果，Park等在小样本APAP诱发肝损伤患者研究这两种miRNAs血浆水平，发现miR-122 和miR-192在APAP诱发肝损伤患者比无肝损伤患者被大幅抬高。上述的miRNAs水平也有抬高。在同一组的后续研究中，测定miR-122以及其他细胞死亡标志物，发现对预测APAP诱发肝损害来说，前者明显优于ALT、INR和血浆对乙酰氨基酚浓度。

图3. miRNA机制. Pre-miRNA（microRNA前体）被Drosha处理，一种核核糖核酸酶III酶，被输出到细胞浆。在这里pre-miRNA由Dicer操作到miRNA。miRNA是松开的单股RNA，加载到RISC复合物。RISC复合物主要结合靶基因的3′UTR，会导致翻译抑制。一些 miRNA-RISC复合物结合到目标序列的ORF (开放阅读框)，致使信使RNA (mRNA)降解，miRNAs可以被封装成微粒子，释放进血流。

最近已经探索各种miRNAs作为疾病严重性的生物标志物在各种慢性肝病的可能性。Yamada等结果显示miR-122血清水平，以及miR-21、miR-34a和 miR-451在NAFLD患者均增高，当诊断时基于超声检测肝脏脂肪时，miR-122水平与肝脏脂肪变性的严重性相关。此外，miR-103/107水平在ALD、NAFLD和NASH患者肝活检标本均有增加，这些水平与胰岛素抵抗密切相关。还有，Bala等发现炎症相关miRNAs (miR-155、miR-125b和 miR-146a)在CHC患者血浆增高。同一小组的另一研究应用试验小鼠模型证明这些炎性相关miRNAs的循环水平对肝损害类型的反应是不同的，例如APAP、ALD和TLR9、TLR4 配体相关肝损害。作者们也探究了miRNA释放的机制，发现在ALD和炎性肝损害，血清/血浆 miR-122 和 miR-155主要与囊泡相关，而在DILI/APAP损害时这些miRNAs主要存在于富含蛋白质部分。与这些结果一致的是最近发现在NASH小鼠模型，包含miR-122微泡有肝细胞释放，能在循环中测定（见下文“微粒”）。

许多研究显示。由肝星状细胞（HSC）活化造成肝纤维化可能被miRNAs监控。Lakner等最近显示miR-19b在啮齿类和人类肝纤维化时被降低。类似的研究在四氯化碳诱导肝纤维发生的小鼠模型，以及在晚期肝硬化患者发现miR-29家族成员减低。Venugopal等用小鼠胆管结扎纤维化模型描述miR-150 和miR-194水平减少。同样，miR-122的血清水平与CHC患者纤维化的严重性负相关。严重纤维化患者水平是降低的，而纤维化早期阶段和高炎症活动患者显示miR-122水平增加。另一方面，在啮齿类和人肝纤维化观察到miR-214-5p 和 miR-221/222水平增加。几个关键领域未来研究包括评估肝脏microRNA释放入血液和其他潜在生物流体库的机制和动力学，以及建立不同的间隔，例如细胞外囊泡，在各种肝脏疾病过程中构成循环miRNAs的主要来源。在APAP和非APAP急性肝损伤以及各种慢性肝病未来的前瞻性和纵向生物标志物研究，需要确定是否miR-122进入孤立，或与其他miRNAs结合，为了创建miRNA剖面图，为当前可用的工具提供额外的临床效用和预后价值。

微粒

微粒(MPs)是小的膜小泡，在高度监管的方式下从死亡或者激活细胞释放。MPs形状范围在100-1000 nm之间，通过细胞膜脱落而产生，该过程涉及膜蛋白进入脱落MP的排序和细胞活化期间或凋亡早期。磷酯酰丝氨酸从内到外膜的转位。MPs可以分类为细胞到细胞的通讯器。它们携带特殊特征如表面受体、完整膜、细胞溶质和核蛋白，RNA包含来自父母细胞的miRNAs并传送这些特征到其他细胞（图3）。尤其MPs不仅逗留在原始组织，而且也可以流通进入血流。肝损害期间MP释放进入循环的最初报告来自AM Diehl组，他们用胆管结扎(BDL)小鼠模型证明血液和胆汁MP增高。Diehl组继续研究显示这些MPs包含生物学活性刺猬（Hh）配体，提供的证据提示肝脏窦状隙内皮细胞上Hh信号激活可能是淤胆型慢性肝损害期间MPs有助于组织重构的重要机制。最近，作者在饮食诱导NASH小鼠鉴定出循环MPs释放，可以作为NASH诊断潜在和新的生物标志物。当给予小鼠暴露超量饱和脂肪酸时，释放的膜结合微粒诱发血管生成。小鼠食源性脂肪性肝炎血液中的微粒源自肝脏，当应用于内皮细胞系时触发迁移和管状结构形成。微粒的血管生成效果由肝细胞暴露于饱和脂肪酸，或者来自于小鼠食源性脂肪性肝炎；包括内皮细胞摄取微粒，该过程需要Vanin-1，一种位于微粒表面的酶。因此，可能发生在脂肪性肝炎的病理性血管生成通过防止内皮细胞内化从肝细胞产生的Vanin-1阳性微粒而减低。最近有实验研究报告了MP测定在人类疾病的相关性。Rautou等报告肝硬化患者leuko-endothelial-derived CD31(+)/41(−) MPs、 pan-leukocyte-derived CD11a(+) MPs、lymphocyte-derived CD4(+) MPs和 erythrocyte-derived CD235a(+) MPs 循环水平升高。Kornek 和Schuppan的两项最近的研究显示MPs positive各种炎细胞标志物如CD4(+) 或 CD8(+) T细胞, CD14(+) 单核细胞, 和iNK 细胞能在各种肝病患者血浆中检测到。尤其，循环MPs 阳性单核细胞标志物CD14、或iNK 细胞标志物在NASH患者比肝脂肪变性患者要高的多，而慢性丙肝感染患者MPs阳性CD4和CD8 T细胞标志物的水平增高。因此，胞外膜泡，尤其MPs，对各种急性和慢性肝病肝损伤的诊断和监视是在不断发展的有吸引力的生物标志物。 MPs 不仅携带着细胞来源的特定特征，而且在肝损伤的发病机制和进展上也会是很重要的。

未来的研究更好的评估MPs存在于血液的属性，涉及它们产生的机理 ，以及它们可能促使肝损伤的发病机理和进展。

结论

肝细胞死亡是急慢性肝损害相关肝损伤的主要机制。涉及触发细胞死亡信号事件的日渐理解允许对致使肝细胞死亡不同分子途径的深入探讨。经典的肝细胞死亡模型提出有两个相互排斥的形式：程序化的，或者凋亡细胞死亡，遇意外相对的，或坏死性细胞死亡，根据形态学标准。但是，最近的突破已经确定了一些细胞死亡模型在细胞死亡的执行中呈现串扰和协作。最近的证据表明在这些过程某些细胞内和表面蛋白被裂开和/或从肝细胞释放，促使发展很有趣的潜力很大的监视肝细胞死亡非侵入性标志物。这些标志物在实验模型和各种肝病患者的检测提供了关于细胞死亡在肝损伤中的作用的重要线索，提示细胞死亡的生物标志物可以用作肝损害的标志物（表2）。此外，包括细胞死亡和肝脏特异性检测的一个生物标志物面板可能会增加诊断的准确性。未来的研究为更好地评价这些标志物在不同型急慢性肝损害的作用，以及识别新的肝细胞死亡标志物，在肝损害的诊断、监视和治疗方面都是合理的和可以提供帮助的。

Table 2. 人类肝病的可溶性生物标志物

2014.05.22