cortactin与肿瘤侵袭和转移的关系

cortactin 是位于染色体11q13区上的CTTN基因（以前也称为ESM1基因）所编码，具有多种不同细胞功能的蛋白质，1991年最初是作为致癌的酪氨酸蛋白激酶v-src的底物而被鉴定发现的^[1]。cortactin是一种在皮质亚细胞局部聚集并且能和丝状肌动蛋白（F-actin）结合的蛋白质，也因此被命名为皮质肌动蛋白结合蛋白（cortical actin binding protein）简称cortactin^[2]。由于cortactin作为Arp2/3复合体（肌动蛋白相关蛋白复合体 actin related protein complex 2/3）直接结合的蛋白启动肌动蛋白的聚核，进而调节肌动蛋白细胞骨架，所以在足突和板状伪足形成、膜胞输送、细胞内吞噬、轴突导向和神经元极化、病原体侵入细胞、肿瘤和侵袭、转移的形成等方面都起着作用。近年来人们将目光主要投向肿瘤领域，在许多肿瘤中发现CTTN基因的扩增和cortactin的过表达与肿瘤的侵袭和转移有着密切的联系。

cortactin的结构

cortactin是个单体不对称狭长的长度约为220-290Å (1 Å=0.1 nm)的蛋白质分子，在人类、啮齿类动物和鸟类cortactin存在一个保守的分子结构并具有高度序列相似性，它的N末端区域大约有90个氨基酸序列,结构不清，但有一个21-22个氨基酸残基的酸性区域，被命名为N末端酸性区域（NTA）^[3]，此区域能与Arp2/3复合体结合，这个NTA区还包含有一个称为DDW的模体（motif），这对于结合Arp2/3复合体中的Arp3亚单位是必需的。之后是连续6个每个长37个氨基酸残基和1个长23个氨基酸残基组成的重复串联序列区，其中第四个重复序列对于与F-actin结合是必需的，而与之有效结合则需要第三和第五个重复序列^[4]。这前两个部分被称为肌动蛋白结合和聚合作用区，缺乏NTA和第四个重复区的cortactin变体，则不能聚集在细胞周围，也不能通过Arp2/3复合体引起肌动蛋白的聚核。在人类中有2个因分别缺乏第六重复序列和缺乏第五、六个重复序列的异构体，分别称SV1-cortactin和SV2-cortactin，它们是由选择性剪接编码cortactin基因的10和11外显子而产生的^[4]。在接着的一个约50个氨基酸残基的α螺旋区域之后是一个富含脯氨酸的区域（PRR），具有2个丝氨酸磷酸化和3个c-src酪氨酸磷酸化位点，此区域称为调节区域；C末端是一个能与多种蛋白比如能与N-WASP、SHANK3、CBP90、ZO-1、 Dynamin等结合引起多种不同细胞效应的SH3区(Src癌基因家族同源结构域 Src homology 3 domain)，此重要区域称为信号分子结合区域^[5]。

cortactin与肿瘤

一、cortactin与头颈部肿瘤

大约29%的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC head and neck squamous cell carcinomas）患者中存在染色体11q13区的扩增。虽然染色体11q13区还包含许多已知的原癌基因，如cyclinD1、FGF-3、FGF-4、BCLL等，但只有CTTN和cyclinD1在大多数癌症中随着染色体11q13区的扩增而过表达。近年来，对cortactin在HNSCC中的研究较多，有学者用平均随访5年的176例HNSCC组织微阵列免疫组化方法进行回顾性研究，77例（44%）HNSCC存在cortactin的过表达，而且与TNM分期和组织学分级呈正相关，cortactin的过表达显著增加局部复发率、降低5年生存率^[6]。在HNSCC亚族的喉癌中，通过对106例喉癌病人cortactin、cyclinD1、FADD的免疫组化分析得出只有cortactin独立于cyclin D1和或 FADD ，可作为晚期喉癌的降低疾病特异性生存率的预测指标^[7]。在口腔癌中，CTTN基因的扩增同样与淋巴结的远处转移，组织分化差和预后有相关性^[8]。因此，cortactin可能作为HNSCC患者疾病进展和观测预后的一项指标和可能的治疗靶点，具有临床应用价值。

二、 cortactin与乳腺癌

约15%的乳腺癌患者存在染色体11q13区的扩增，而该区域的EMS1和cyclinD1最引人注目^[9]。近来Callagy等^[10]运用在组织微阵列上荧光原位杂交（FISH）分析232例原发性乳腺癌，EMSI扩增甚至达26%。同样，EMS1基因编码的cortactin过表达可导致肿瘤细胞的侵袭性能增强，在乳腺癌中还发现与肿瘤转移和复发等有关，Li等^[11]将过表达cortactin的乳腺癌MDA-MB-231细胞注射入裸鼠心室中，结果癌细胞骨转移率大大提高 ( 85%) ,穿透上皮和上皮细胞的黏附的能力也大幅度增强 ( 62%～70%) ,从而在体内实验水平证实了 cortactin能够促进肿瘤细胞转移。另有学者用RNA干扰技术证实了cortactin支持CD44促进乳腺癌细胞侵袭和黏附到骨髓内皮细胞^[12]。有趣的是，cortactin还与雌激素受体阴性的乳腺癌的预后差有极高相关性^[13]。

三、cortactin与肝癌

Chuma等^[14]从39个基因中选出与转移潜力显著相关的cortactin做为研究对象，在体内和体外对cortactin对细胞运动和转移能力的实验发现过表达的cortactin在无转移能力的人类肝细胞癌（HCC）的细胞株中增加细胞的运动性，在有转移能力的细胞株中沉默cortactin则可以减少细胞运动性；在体内过表达的cortactin能增加肝癌细胞的运动性和肝内转移。Yuan等^[15]通过用比较基因组杂交方法发现，在人原发性肝细胞癌中，染色体1p32和11q13存在高度的扩增，用代表差异表达分析法（RDA:respresentatial difference analysis）分离出10个扩增片段，其中一个就与EMS1基因吻合，他们还发现17例的HCC中有3例EMS1扩增，余下的14例中有12例EMS1的mRNA过表达。这些都表明cortactin的过表达与肝细胞癌的发展有密切联系。

此外在实验中观察到，结直肠癌中cortactin在侵袭潜能强的癌细胞中呈强免疫染色，并在培养的癌细胞粘附端伸出的板状伪足中富集^[16]。胃腺癌、食道癌、肺癌、膀胱癌、宫颈癌等肿瘤中也存在CTTN基因的扩增和或cortactin过表达，并且与肿瘤的发生发展，侵袭转移均有着密切关系。

cortactin 在肿瘤发生发展过程中的可能机制

一、 cortactin在细胞内的磷酸化状态

cortactin的磷酸化有多种生理作用，其磷酸化水平与细胞运动存在正相关。肌动蛋白重组易受磷酸化作用影响。Src可以磷酸化cortactin脯氨酸富集区的3个酪氨酸残基（Y421,Y466,Y482）,有趣的是cortactin酪氨酸磷酸化是以一种进行性方式进行的，即先作用于Y421，之后是Y466。Martin等^[17]用质谱法测定出cortactin磷酸化的17个新位点，包括12个丝氨酸，4个苏氨酸和1个酪氨酸残基位点。而富含脯氨酸区还受丝氨酸/苏氨酸激酶作用，主要是MEKs-ErK激酶通路，但是在对凝血酶诱导的血小板的片状伪足的伸展中，Rac-PAK（p21-actived kinase）激酶通路也调节cortactin的丝/苏氨酸磷酸化^[3]。cortactin丝氨酸磷酸化增强N-WASP介导的肌动蛋白的聚核，相反酪氨酸磷酸化显著减少了这一效应甚至抑制cortactin的丝氨酸磷酸化，如此支持了cortactin的Erk或者src磷酸化作为一个N-WASP的开关，在细胞骨架形成中具有重要意义，这样一个“S-Y”开关在肌动蛋白重组中允许大量cortactin被循环利用。例如在细胞运动中在前缘cortactin酪氨酸磷酸化能帮助释放cortactin，随后在再次合并到快速伸出的细胞边缘之前去磷酸化。可以想像对磷酸化和非磷酸化的cortactin单体水平的适当调节维持了肌动蛋白的重组^[4]。Huang 等^[18]观察到在小鼠黑色素瘤中src酪氨酸家族激酶的Fyn和cortactin起协同作用，调节细胞运动和在远处转移中的转移潜能。虽然cortactin由CTTN单基因编码，但是在SDS-PAGE上出现了两条带，分子质量分别为为80、85kd，因此也称为P80和P85，被观察的HEK293细胞中，cortactin过表达有两种形式，用表皮生长因子（EGF）处理则P80向P85转化，而这一过程被MEK抑制剂PD98059阻断，而且用³²P－磷酸盐标志代谢发现，在静止细胞中只P80被检测到。最近在结直肠癌研究中发现，cortactin的一个单体p85在结直肠癌组织中占主导地位，而p85是由p80通过翻译后的磷酸化等修饰而来的^[16]。

总之，cortactin磷酸化过程是连接其外部信号并引起细胞构架变化的关键所在，对于细胞及时对外界刺激的反馈有关，并在肿瘤的进程和侵袭转移中有着密切联系。

二、与cortactin结合的有关蛋白引起的细胞骨架变化

cortactin主要通过Arp2/3复合体促进和稳定肌动蛋白支链,从而为细胞质膜提供结构支持和动力等，最终形成肌动蛋白网状结构，肌动蛋白单体聚合形成微丝，而微丝与中间丝及微管构成细胞骨架，所以，cortactin参与的细胞骨架调节对于肿瘤细胞来说是非常重要的。能与cortactin结合起作用的蛋白很多，而在肿瘤形成中起主要调节的有以下一些：

1. Arp2/3复合体、N-WASP、WIP：自从通过质谱分析鉴定出Arp2/3复合体之后，cortactin在肌动蛋白组装中作用才渐渐明朗，与cortactin结合起作用最主要的且对形成细胞骨架必不可少的是Arp2/3复合体，它是有Arp2和Arp3及五个结合多肽组成（分别为ARPC1、2、3、4、5）。cortactin的NTA区域与Arp3亚基结合，第四个重复序列与F-actin结合形成F-actin-cortactin-Arp2/3三元复合体，Arp2/3结合到已经存在的肌动蛋白纤维丝上，并与原来的肌动蛋白纤维丝呈70°角形成一个新的肌动蛋白纤维丝的起点，cortactin除了提供F-actin结合位点外还有抑制已经形成的分支的解聚而稳定F-actin网状结构作用^[5]。cortactin与Arp2/3结合有微弱的肌动蛋白聚核作用，而当Arp2/3复合体被成核促进因子NPFs（nucleation promoting factors）激活并与cortactin协同后，其作用进一步加强。两类重要的NPFs是WASP(Wiskott Aldrich syndrome protein)和SCAR/WAVE蛋白^[3]。N-WASP(neural WASP)与cortactin的SH3结构域作用后促进原先的cortactin与Arp2/3对肌动蛋白聚核的作用。其他如WIP（WASP-interacting protein）和dynanim也能与SH3结合促进聚核作用^[19]。

2.TME7(肿瘤血管内皮标志物-7)：TEM是在肿瘤血管形成中高表达的蛋白，TEM7在各种人类肿瘤如乳腺癌、结直肠癌、肺癌等肿瘤上皮细胞中丰富表达，而在非肿瘤组织中缺失或者表达稀少,Nanda等^[20]利用亲和提纯等方法发现cortactin可与TEM7结合，研究表明，TEM7结合位点接近于cortactin的SH3结构域的9个氨基酸序列区，不可否认的是不管cortactin是否是TEM7的生理配体，这9个氨基酸结合域是个对肿瘤内皮了解的有用工具。

3.Hax-1蛋白:Hax-1（HS1相关的X-1）蛋白，最初作为一个HS1结合分子被分离出来而，而HS1(造血系细胞特定蛋白1)在结构上与cortactin相似，作为白细胞中酪氨酸激酶的底物，HS1缺乏能与F-actin结合所必需的第四个重复序列。Hax-1，一个细胞骨架相关，与cortactin相互作用的细胞内蛋白，两者的相互作用对于Gα13（一个异源三聚体G蛋白G13的α亚单位）刺激细胞迁移所必需的，, Gα13，Hax-1，Rac和cortactin形成复合体调节细胞运动^[21]。我们可以推测cortactin通过与Hax-1作用参与了细胞骨架的调节和细胞运动，也进一步在肿瘤发生发展中起作用。

4.AMAP1（ADP核糖基化因子GTP酶激活蛋白的一种）:Hashimoto 等^[22]发现AMAP1与桩蛋白和cortactin形成三蛋白复合体，AMAP1作为一个GTP-Arf6效应子在具有侵袭活性的乳腺癌细胞中鉴定出来，在这个复合体中，AMAP1通过它的脯氨酸富集肽SKKRPPPPPPGHKRT结合到cortactin的SH3上，并且AMAP1可同时与两个cortactin的SH3结构域结合。这个AMAP1介导的三聚体，只在侵袭性的癌细胞中被检测到，并在体外和转移的小鼠中阻止这个复合物的形成有效抑制它们的侵袭活性。并由此提供了一个可能的对乳腺癌侵袭治疗的靶点^[23]。

三、cortactin与黏附素在肿瘤中的作用

细胞间、 细胞与基质间都是通过黏附素连接起来 ,一般是整合膜蛋白 ,与胞内骨架系统相连 ,在肿瘤侵袭和转移过程中起着重要的作用。黏附素种类繁多 ,与肿瘤关系密切的主要有钙粘蛋白 , 免疫球蛋白类黏附分子和选择素等。

钙粘蛋白黏附分子是个单通路的跨膜蛋白，它调节钙依赖性细胞之间的黏附，cortactin在细胞之间黏附接触处被招募并且和E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白相互作用，有研究证明，在E-钙粘蛋白依赖的细胞之间接触，在钙粘蛋白黏附接触处抑制细胞内cortactin活性将显著降低Arp2/3复合体依赖的肌动蛋白组装并且在极化的上皮细胞中扰乱了细胞形态和钙粘蛋白的接合性堆积。作为对细胞内黏附作用的反应，cortactin在其酪氨酸残基421上的磷酸化被认为对于钙粘蛋白介导的细胞内黏附力量所必需的。因为钙粘蛋白表达缺失与以侵袭性生长和转移为特征的晚期肿瘤的形成有关，故揭示细胞与细胞之间联系的调控机制具有很大重要性^[24]。

四、cortactin在形成侵袭伪足（invadopodia）中的作用

在体内，细胞运动并穿过组织需要降解细胞外基质（ECM），而cortactin被发现在此过程中起重要作用，转移性的肿瘤细胞通过依赖侵袭伪足降解ECM才能侵入和迁徙到周围组织，侵袭活性的癌细胞中通常具有侵袭伪足。cortactin在侵袭伪足中高度富有，且与桩蛋白和PKcμ（蛋白激酶cμ）形成复合体，调低cortactin则抑制这种结构形成。实验中用多克隆抗cortactin抗体微注射进侵袭伪足则阻断了侵袭伪足对基质降解，cortactin在活化的侵袭伪足中高度磷酸化，且其水平与伴发的基质降解成线性关系，故可以认为cortactin可以调节伪足对基质的降解^[24]。

在对乳腺癌细胞株MDA-MB-231中用小干扰RNA（siRNA）抑制实验确立了cortactin对侵袭伪足结构的形成是必需的，而用蛋白酶抑制剂研究表明，膜型蛋白金属蛋白酶1（MT1-MMP）对于相关基质降解来说是个关键的酶，于是Artym等^[25]提出了一个侵袭伪足形成和起作用的四阶段降解模型：即cortactin聚集到黏附在基质的细胞膜上；MTI-MMP在cortactin聚集的地方堆积；在侵袭伪足区域的基质降解；和随后的cortactin从继续堆积的MT1-MMP与局灶降解联系的区域中游离出来。cortactin调节侵袭伪足中重要的MMPs（包括MMP-2、MMP-9和MT1-MMP）的分泌^[26]。最近研究发现，cortactin的NTA和SH3结构域分别和Arp2/3 复合体和N-WASP结合和激活，这两者是侵袭伪足发生所必需的。而且，通过RNA干扰和广泛cortactin磷酸化突变显示，侵袭伪足的形成和细胞外基质的降解需要Src家族激酶，Erk1/Erk2 和 PAK对cortactin 磷酸化的调节，而cortactin作为一个支架蛋白聚合不同的对于侵袭伪足形成来说必需的成分^[27]。

从cortactin被鉴定以来，现已清楚，cortactin在调节各种细胞活动例如囊泡运输、肌动蛋白聚核细胞骨架形成、伪足小体/侵袭伪足形成、细胞转移起着重要作用。所以一旦这些调节细胞运动过程有变化，将可能导致肿瘤的发生发展，由于cortactin在许多肿瘤中过表达，且实验证实，在许多肿瘤中上调cortactin水平导致肿瘤发生发展，然而很多实验表明cortactin在肿瘤转移而不是在原始发生中起作用，而且染色体11q13还含有其他很多的癌基因，而其中很多基因表达产物是否与cortactin作用，是否与肿瘤发生发展有关，所以还需要进一步实验证明，对cortactin的功能的研究将不仅仅更好地使我们了解生理状态细胞的运动，而且对于在肿瘤中的肿瘤细胞的侵袭和转移有更多新的观念，同时cortactin可能作为一个潜在的药物靶点为肿瘤的治疗提供新的方法和希望。