膝关节骨软骨损伤的治疗策略

既往数十年中关节软骨损伤的治疗已取得了重要进展, 但深达软骨下骨的骨软骨损伤未得到足够重视。 骨软骨损伤是同时累及关节软骨及其下方软骨下骨的损伤, 临床中不同病因引起的骨软骨损伤发生病变的位置、大小、破坏程度有一定差异, 病理特征各不相同, 主要发生于创伤性骨软骨损伤、剥脱性骨软骨炎、骨坏死、骨关节炎等。骨软骨损伤通常需要外科手术治疗, 如果形成与天然透明软骨不同生物力学属性的纤维软骨, 将导致软骨下骨进一步退变, 并引发相邻正常软骨恶化导致的严重疼痛、关节畸形及关节活动度丧失。 基于不同原因导致的骨软骨缺损导致了其治疗的复杂性。

骨软骨结构模式图

1传统临床治疗策略

临床治疗方法可根据骨软骨缺损的发病部位及修复方法分类。姑息性治疗一般不替换损伤的软骨和骨, 而修复性治疗常采用一些生物学物质替换缺损区;然而由于软骨、骨和软骨- 骨界面的特定性质, 再生性治疗是较为理想的修复方法, 有助于重建天然组织。

骨软骨损伤示意图及MRI表现

1.1姑息性治疗

对软骨侵害性最小的临床治疗方法是关节镜下清理术, 作为一种姑息性治疗方法, 其主要去除损坏的软骨和/ 或骨, 但不进行替换[1]。术中需先灌洗患处, 然后清除不稳定的软骨碎片、增生的滑膜、退化的半月板及韧带游离体, 剔除骨赘等[2]。虽然关节镜下清理术具有微创的优点, 但这种方法对大块骨软骨损伤无显著疗效[3]。与关节镜下清理术类似的关节磨削成形术与软骨成形术, 通常也被认为是微创姑息性治疗方法。关节磨削成形术是在损伤区域打磨出一个粗糙面, 导致出血凝结, 从而形成纤维软骨, 但这种方法不直接穿透软骨下骨[4]。软骨成形术是将受损软骨的锯齿状边缘变得平滑, 但此方法有临床局限性[5]。

关节镜下微骨折术

1.2修复性治疗

自20世纪80年代开展微骨折技术以来, 该方法已成为临床软骨修复的常用技术, 其主要是在关节镜下清理损坏的软骨至正常软骨边缘, 然后在软骨下骨上钻孔使BMSCs通过血液到达软骨缺损处形成血凝块, 最终形成纤维软骨充填骨软骨缺损[6]。该方法操作简便, 对于小面积软骨损伤治疗结果较满意, 因此在临床上广泛应用;但不足之处是需进行长时间的术后康复治疗[7]。使用异体移植和自体移植技术修复软骨和骨软骨缺损是有创操作, 两种骨软骨移植物均可应用软骨镶嵌技术 (马赛克移植技术) 治疗骨软骨损伤。 自体骨软骨移植是采用非负重面的骨软骨填塞移植修复缺损部位, 其移植过程可通过关节镜和关节切开两种方法实现, 因非负重面骨软骨来源有限, 自体骨软骨移植主要应用于中小面积骨软骨缺损[8]。而异体骨软骨移植通过选择合适供体, 进而获得合适大小和外形的移植物, 能够一次性有效修复较大面积的骨软骨缺损[9];但免疫排斥反应是异体骨软骨移植能否成功的重要问题。

软骨镶嵌技术 (马赛克移植技术)

1.3再生性治疗

目前对于软骨损伤公认的再生性治疗方法是自体软骨细胞移植 (autologous chondrocyte implantation, ACI) , 自1994年被首次报道以来经过了多次改进[10]。 第1代ACI技术采用自体软骨细胞单层体外培养及关节切开两阶段细胞植入, 骨膜或胶原膜覆盖封闭植入软骨细胞, 其生成的软骨为透明软骨和纤维软骨的混合物。第2代ACI技术改进为更简单的两阶段法, 在第一阶段进行关节镜评价和活检, 收集自体软骨细胞分离扩增;第二阶段采用胶原膜覆盖软骨细胞- 支架复合物, 避免骨膜肥大并发症, 也有学者尝试采用三维支架将细胞分布均匀并防止细胞从软骨缺损部位流失[11]。基质诱导ACI (matrix-assisted ACI, MACI) 技术是将自体软骨细胞接种于经纯化处理的猪Ⅰ / Ⅲ型胶原膜, 体外培养4周后, 二期采用纤维蛋白胶将细胞- 支架复合物移植于缺损区域。但ACI和MACI技术的局限性是需二次手术、术后恢复时间相对较长、植入的软骨细胞成熟缓慢[12]。

自体软骨细胞移植

异体骨软骨移植

2组织工程治疗策略

组织工程学研究领域涉及材料学、工程学及生命科学, 只有将其发展的最新策略应用于骨软骨组织工程范畴, 并联合支架、细胞、生长因子等相关要素的协同作用, 才可能充分恢复软骨及软骨下骨的正常功能和力学特性。

组织工程

2.1骨软骨组织工程传导支架

为了模拟体内细胞外基质的三维环境, 组织工程需要构建一个组织传导体系, 为周围再生组织提供结构支撑, 为细胞迁移、黏附和分化提供空间[13]。骨软骨支架材料的性质一直被广泛研究。天然材料具有良好的生物相容性和可降解性, 可模仿细胞外基质的某些特性, 促进细胞黏附、迁移、分化和细胞外基质沉积; 但天然材料也存在缺点, 如免疫原性、加工困难和传播动物病原体的潜在风险。此外, 如果不进行适当的化学试剂交联, 材料植入后将快速降解导致机械强度减弱[14]。合成材料因具有易成型、生产便利和可控降解能力, 已被广泛用于组织工程的体内、外研究[13]。最常用的可生物降解合成聚合物包括聚 α- 羟基酸, 如聚乳酸 (polylactic acid, PLA) 、聚乙醇酸 (polyglycolic acid, PGA) 以及二者聚合物 (poly lactic-co-glycolic acid, PLGA) , 聚已酸内酯、聚丙烯富马酸盐、聚二恶烷酮等[15]。虽然合成材料具有生物相容性, 但其体内降解时的水解反应可能会导致局部pH值降低和炎性反应发生[16]。此外, 由于天然软骨和骨具有完全不同的机械刚度和材料结构属性[17], 导致了组织工程策略修复骨软骨缺损的复杂性。目前基于骨软骨支架的研究已从单相设计逐渐趋于双相或多相分层的仿生设计和成分优化。

2.1.1单相支架

单相支架是应用单一材料根据缺损区形态先预制成型再填充的技术, 是组织工程最早应用于骨软骨缺损修复的支架。制备单相支架的常用材料包括羟基磷灰石 (hydroxyapatite, HA) 及一些聚合物, 如PLGA和聚已酸内酯[18,19], 这些材料制备的支架具有良好的降解率、不同强度和孔隙率, 可供模拟周围组织的特性, 从而促进与宿主组织的充分整合。早在1995年Chu等[20]即应用聚左旋乳酸颗粒制备骨软骨支架, 并进行了体内、外实验研究, 结果表明虽然聚合物支架可为细胞的黏附和存活提供良好支持, 但体内移植后基质分泌大部分为Ⅰ型胶原。此外, 单相支架也可由多种材料混合组成, 比如将凝胶混合添加于聚合物支架的孔隙中[21]。

支架的设计与制备也会影响实验结果。在一项支架结构的研究中, Malda等[22]采用两种不同加工方法 (压缩塑形与三维纤维沉积) , 制备出可生物降解且具有不同孔隙结构的聚合物支架 (聚对苯二甲酸乙二醇酯/ 聚对苯二甲酸丁二醇酯) 。其中, 采用压缩塑形法制备支架平均孔径为182 μm, 而三维纤维沉积法制备支架为525 μm;支架复合软骨细胞后的体、内外研究显示, 二者的DNA含量、糖胺聚糖 (glycosaminoglycan, GAG) 含量、力学性能均有显著差异。也有学者采用聚乙烯异丁烯酸复合硫酸软骨素以低密度电纺丝纳米纤维技术制作单相支架[23], 复合羊MSCs并向软骨诱导, 体外培养后发现其具有与透明软骨相似性状并更具力学弹性;细胞增殖能力和细胞外GAG含量显著增加, 并可见软骨细胞陷窝形成;免疫组织化学染色示, 硫酸软骨素可促进Ⅱ型胶原生成, 但对Ⅰ型胶原无作用。

目前研究较多的单相支架是胶原蛋白支架[24], Zhou等[25]曾进行了单相胶原支架和双相胶原/HA支架体外对比研究, 发现两种支架复合人BMSCs后, 在成软骨培养基中培养3周后阿尔新蓝和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性, 而在成骨培养基中培养3周后茜素红和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性;但单相胶原支架在成软骨方面表现更好, 而双相胶原/ HA支架在成骨方面更具优势。

以上研究表明, 单相支架可为软骨细胞或骨细胞的黏附和扩增提供良好支持, 但单相支架缺点是缺乏再生骨软骨组织的内在物理结构。

2.1.2双相或多相支架

有学者提出, 为更好地完成对软骨和软骨下骨的同时重建, 应使用双相或多相支架修复骨软骨缺损[26]。构建双相支架通常采用两种不同材料, 一种构建软骨层, 另一种构建软骨下骨/ 骨层; 多相支架则需加入第3种材料来构建界面层, 以模拟天然骨软骨组织两层间过渡区 (潮线周围) 的特性[27,28]。 由于双相或多相支架包含两个独立部分, 如果不考虑过渡区的必要性, 支架植入体内后可能发生分离, 导致骨软骨重建失败[29], 所以恰当构建含有过渡区的双相或多相支架, 可能提供一种合理的组织修复方法。常用于构建双相支架的材料很多, 有学者[30]进行了一项不同材料构建的双相支架体内对比实验研究, 将Ⅰ型胶原/GAG双相支架与PLGA/PGA双相支架分别用于修复山羊骨软骨缺损模型, 12周后Ⅰ型胶原/GAG支架更为坚强并可提供牢固的力学支撑;26周后Ⅰ型胶原/GAG支架组的修复缺损区内可见大部分为透明软骨填充, 组织学评分优于PLGA/PGA支架组。Chen等[31]也研发了一种双相支架, 上层为胶原蛋白海绵, 下层由PLGA与Ⅱ型胶原按75 ∶ 25比例复合材料构成。他们将BMSCs种植至该双相支架上体外培养1周后植入体内修复股骨髁骨软骨缺损, 4个月后结果显示缺损区表面修复光滑, 与周围组织整合良好, 组织学染色示有软骨样组织生成和软骨下骨重建完成。 Deng等[32]也构建了一种双相支架, 上层由明胶、硫酸软骨素和透明质酸钠组成, 下层由明胶和脱钙小牛骨组成;将兔软骨细胞和BMSCs成骨诱导培养5 d后复合于双相支架植入体内修复兔膝关节股骨远端大块缺损, 组织学结果显示软骨层有透明软骨形成, Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性, 软骨下骨层骨生成良好, 茜素红和ALP染色阳性;力学结果示修复组织的软骨和骨层均具有良好的抗压缩强度, 与天然骨软骨组织的数量级相当。在最近的一项研究中, Da等[33]采用三维打印技术构建了一种含中间致密层的双相骨软骨支架, 于骨层和软骨层分别种植自体成骨细胞和成软骨诱导的BMSCs后植入兔膝关节骨软骨缺损处, 结果显示这一致密层能显著提高双相支架的生物力学性能, 且骨软骨组织再生良好。

2.2骨软骨组织工程生长因子

通常情况下, 单独应用支架材料并不能为骨和软骨再生提供足够支持。因此, 采用各种方法适当添加不同浓度生长因子对缺损组织的再生是非常必要的, 生长因子的种类和浓度选择不当可能引发软骨细胞的 “终末分化”现象, 继而发生软骨内骨化导致新生软骨退变[34,35,36]。目前发现许多生长因子对骨/ 软骨细胞的生长和迁移有特定影响。研究表明BMPs对刺激新骨/ 软骨形成有强大作用[15，37];此外, EGF、PDGF、FGF、 甲状旁腺激素相关肽、IGF、TGF-β、VEGF等因子也具有不同程度的促进功能[16，35]。生长因子在病变部位的空间分布以及不同时间内的释放浓度对骨软骨再生的疗效也有显著影响。常规给药方法包括全身用药、缺损部位注射[14], 但由于生长因子蛋白半衰期较短, 无法长期维持有效药物浓度, 常需要高剂量注射才能弥补该缺点[38]。最近有大量研究[39,40,41]应用丝素蛋白微球、 多孔PLGA及壳聚糖三维支架等作为载体, 包被多种生长因子制作成梯度浓度释放的缓释系统, 可为种子细胞提供长期有效的生长因子微环境。

2.3骨软骨组织工程种子细胞

大量研究表明, 应用软骨细胞体外修复骨软骨缺损更有益于功能性软骨组织的再生[42,43,44]。但机体内软骨细胞来源较少 (< 5% 软骨体积) , 不仅取材困难, 且分离时采用胶原酶消化对软骨细胞有破坏性作用[45], 导致体外培养和扩增时引起表型缺失而发生去分化现象[46]。已有研究试图寻找胶原酶消化的最佳浓度和孵育时间, 以便提供更多解决方案[47]。基于干细胞在细胞治疗和组织工程中的重要作用, 目前已有多种干细胞应用于骨软骨组织工程。BMSCs是一种可自我更新、向不同谱系分化的多功能祖细胞, 是治疗骨软骨缺损很有前景的种子细胞来源[48], 已有大量研究表明, BMSCs在体外 (通过使用生长因子) 可促进软骨形成[49]。滑膜MSCs具有较大的成软骨分化潜能, 因其取材方便, 且不同年龄捐献者的细胞在体外培养扩增超过10代仍可保持多谱系分化潜能而倍受关注[50];有研究者将滑膜MSCs接种至琼脂糖凝胶支架上, 构建出的组织工程组织具有与天然组织相当的力学和生化特性[51]。脂肪组织中也含有大量MSCs, 可广泛用于骨、 软骨、脂肪、肌肉、神经再生医学领域[52,53], 比BMSCs更具遗传稳定性[54]。脐带血已成为MSCs的另一重要来源, 脐带血干细胞在体外更具成软骨细胞分化潜能, 与不同材料结合可形成软骨和/ 或骨组织, 成为软骨组织工程更具吸引力的种子细胞来源[55,56,57,58]。

2.4生物反应器的应用

即使有支架、生长因子和细胞的完美结合, 要成功地再生骨软骨组织, 还需要特殊的力学生物学环境。 体外研究需尽可能模拟体内真实环境, 为细胞- 支架复合物提供必要的力学和生物学条件[59]。生物反应器可充分复制体内生物环境, 为种子细胞在生物支架内提供均匀的营养支持, 促进细胞与周围环境的物质传递, 提供物理和化学信号刺激, 有助于组织再生[60]。培养骨软骨移植物的生物反应器是基于影响软骨形成、 骨生成和骨软骨界面形成的力学参数而设计的。研究表明, 在适当条件下, 生物反应器提供的直接压缩应力刺激软骨细胞, 可增加蛋白多糖和胶原的合成, 并提高力学性能[61]。然而, 关节软骨在机体内的受力环境非常复杂, 软骨细胞在关节液中所受的力学刺激还包括张力、剪切力及静水压等[62]。流体剪切力是关节液流动而产生的骨软骨结构之间的剪切力, 可促进废物代谢和营养传递, 基于此观点, 有学者应用旋转式生物反应器培养BMSCs已成功构建出骨软骨移植物[63]。 Wagner等[64]研究发现静水压产生的直接力学刺激能促进人BMSCs的多向分化功能。直接灌注式生物反应器在骨组织工程中已有很多研究, 有学者认为其应用于软骨组织工程中也同样可行[59，65]。总之, 骨软骨组织工程生物反应器的设计有待于进一步完善, 未来研究应致力于设计一种独立的生物反应器, 对骨软骨移植物的双相培养同时达到最佳效果。

生物反应器

2.5适宜的固定

支架固定在组织再生中是关键的一步, 复杂的组织界面再生过程中, 移植物稳定性失效将影响长期临床结果, 因此修复组织的生物固定或一体化仍是重要临床挑战[66]。向临床转化的一个重大障碍是如何实现生物固定与功能整合, 以及如何防止骨骼、韧带或软骨组织工程移植物的界面与宿主环境之间微动[67]。目前治疗小面积骨软骨病变时, 大多数外科医生不使用任何固定系统, 仅依靠纤维蛋白凝块黏附及支架与病变处理部位之间的压配获得支架稳定, 或使用生物相容性胶水 (如纤维蛋白胶) 作为辅助治疗, 以获得支架稳定[68,69]。而纤维蛋白凝块易吸收脱落, 支架几何形状常与病变部位不匹配, 纤维蛋白胶虽保留了支架的完整性, 但支架与软骨或软骨下骨附着力很弱。若采用有创固定方法如软骨移植物缝合, 可能会导致软骨骨折及术后移植物吸收[70]。因此, 为了获得最佳的支架固定同时减少对支架的损坏, 稳定可靠的移植物固定方法是未来研究的热点。

3总结和展望

临床治疗膝关节骨软骨损伤患者时, 进行整体和个性化评估以及全面检查, 对确定治疗方案非常必要。 软骨- 骨界面是维持骨软骨复合单元结构和功能完整性的重要组成部分, 随着对软骨下骨的基础科学和病理生理学机制研究的深入, 以及大量动物实验和临床试验的开展, 对骨软骨损伤修复策略不再局限于单一成分, 而应侧重于骨软骨单元“一体化”的整体研究。

如何重建一个类似天然骨软骨组织的无缝连接的骨软骨界面, 仍是再生医学的一个重大挑战。在骨软骨组织工程领域, 未来应广泛结合材料学、工程学、化学和细胞生物学等多学科最新发展, 共同恢复正常软骨和软骨下骨的功能和力学特性, 为骨软骨损伤的治疗提供最佳解决方案。

参考文献：略

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文字资料来源于作者发表文章： 王永成，等.膝关节骨软骨损伤的治疗策略[J].中国修复重建外科杂志.