循环肿瘤DNA的临床应用现状和挑战

恶性肿瘤因其较高的发病率与死亡率，已成为严重危害人类健康的重大疾病之一^[1]。肿瘤检测技术是恶性肿瘤诊疗的前提和基础。肿瘤检测可以应用于肿瘤治疗前的早期诊断、筛查，肿瘤的治疗以及治疗后的预后评价。目前常用的检测诊断方法有传统的组织穿刺活检、影像学检查等，但是传统检测方法结果不准确和检验过程产生副损伤的缺点严重制约了恶性肿瘤的治疗和肿瘤学科的发展^[2]。因此，全新的肿瘤检测技术一直是国内外专家学者研究的热点问题。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）技术的出现对传统的检测方法而言是一种补充。ctDNA技术在肿瘤检测方面有较高的准确性和安全性，决定了其在肿瘤筛查与治疗领域具有重大的作用和意义。

1 循环肿瘤DNA

ctDNA是血液中游离于细胞外的肿瘤DNA片段，被视为肿瘤细胞中具有特征性的生物标志物。 ctDNA的来源包括坏死或凋亡的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）以及肿瘤细胞产生的外排体^[3]。ctDNA最早在循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）中发现。cfDNA于1948年由Mandel等^[4]首次发现，cfDNA广泛存在于人体的体液中，包括尿液、唾液等，长度为120 ～ 160 bp。血液中cfDNA常维持较低水平，但在急性损伤、感染或较大手术等情况下，cfDNA含量会明显升高^[5]。Yan等^[6]研究发现，肿瘤患者体内的cfDNA 常常会升高，来源于肿瘤的这部分cfDNA称之为ctDNA。ctDNA占cfDNA的比重极低，但有时也可达到90%，其半衰期可从15 min至几个小时不等， 可通过肾脏和肝脏迅速清除^[7]。ctDNA和肿瘤的基因信息可保持高度的一致性^[8]，具有损伤较小、易获得等优点，其在临床的诊疗和预后评估等方面都具有实际意义，因此，ctDNA作为液体活检的热点被广泛研究。

2 循环肿瘤DNA检测方法

随着对肿瘤研究的不断加深，目前在基因层面已经可以实现肿瘤的相关测定，但ctDNA检测技术仍不完善。理论上所有检测基因组信息的方法均能够用于检测ctDNA，但由于ctDNA数量较少、需要扩增和检测方式灵敏度较低等缺点^[9]，使得ctDNA 检测在临床实际应用中依然面临巨大挑战。随着科 技的进步，更多具有特异性的检测技术逐渐被开发 出来。

目前检测ctDNA的技术主要有 ：Sanger法、二代测序（next-generation sequencing，NGS）、实时荧光定量聚合酶链反应（real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）、扩增受阻突变系统（amplification refractory mutation system， ARMS）-聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、数字PCR（digital PCR，dPCR）[包括磁珠乳液扩增技术（BEAMing）和微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）]、靶向深度测序技术等（表 1）。使用以上技术可以对ctDNA进行分析，从而了解病情进展，达到尽早诊断和治疗的目的。

2.1 Sanger法

1977年，Sanger等^[10]首次将双脱氧链终止的原理用于噬菌体varphiX174的基因测定中。 Beaver等^[11]通过对29例乳腺癌患者血液中的PIK3CA 基因进行测定，发现肿瘤基因的突变对指导用药、 评估预后具有重要意义。以Sanger法为核心的第一代测序技术具有检测准确、成本低等优点，但灵敏度差^[12]，且检测通量低，无法满足当前高通量测序的需求。

2.2 NGS

NGS技术因检测通量高、灵敏度高等优势，目前被普遍应用于ctDNA检测，可测定多个已知或未知点突变。该技术应用边合成边测序、平行测序的原理，主要步骤包含 ：DNA文库的构建、 文库分子克隆的扩增、测序和结果的分析。按照实验方法和检测目的的不同，NGS分为两种 ：一种是通过探针和芯片，在目标区域测序，以实现对多个已知基因的测序分析。Molparia等^[13]将25例结直肠癌患者与24例健康人进行对照分析，发现区分两 组基因拷贝数变异的特异度为100%，灵敏度可达 79%。Zhang等^[14]通过对24例晚期胆管癌患者进行基因测序，发现了可靶向的遗传变异信息并指导个体化治疗。另一种是进行全基因组或全外显子测序。 全基因组测序通过对不同的个体或群体进行测序分析，进而对癌症基因组学进行研究。Rossing等^[15] 认为全基因组测序可以分析乳腺癌患者潜在的靶向基因突变，也可以检测癌症患者的染色体变异情况。 全外显子测序是指使用测序技术将收集到的基因组外显子区域的全部DNA进行分析的方法。这两种 方法应用广泛，不受个体限制，但费用较高。

2.3 RT-qPCR

RT-qPCR是一种传统的ctDNA检测技术，目前在临床中应用较广泛^[16]。Vymetalkova 等^[17]通过RT-qPCR分析了结直肠癌患者在接受手术治疗后血液中ctDNA以及KRAS和BRAF基因突变的信息。该方法操作简单、成本低，但通量低，无法检测未知序列^[2]，因此，在ctDNA的实际应用中具有一定的局限性。

2.4 ARMS-PCR

ARMS-PCR利用等位基因特异 性扩增的原理，通过PCR和凝胶电泳检测DNA的点突变。ARMS-PCR根据已知点突变位点设计3条引物，其3‘端碱基分别与突变和正常模板的碱基互补配对，从而将突变模板和正常模板区别出来。Li等^[18] 通过ARMS-PCR技术对263例非小细胞肺癌患者的研究发现，T790M的丰度与奥西替尼治疗的预后相关。该法具有操作简便、成本低、用时较短等优点， 并且灵敏度高，对肿瘤组织的突变检测线可达到 0.01%^[19]。目前，ARMS-PCR被认为是国内外肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，临床检测认可率较高^[20]。

2.5 dPCR

dPCR的概念诞生于1999年，其本质是一种核酸分子绝对定量技术，其在ctDNA的研究中发挥了重大作用。尽管dPCR和RT-qPCR技术有相似点，但二者对核酸的定量方式有很大区别。RT-qPCR根据参照基因或标准曲线来确定核酸量，而dPCR是分配扩增，终点检测，可以直接明确DNA分子的数量， 无需参照，灵敏度可以达到0.001%^[27]。

2.5.1 BEAMing

BEAMing是指将每一类DNA与磁珠相连接，在乳浊液中进行PCR反应，然后使用带颜色的荧光探针进行标记，通过标记和磁珠的颜色来评估突变的情况。这种技术包含珠子（bead）、 乳浊液（emulsion）、扩增（amplification）、磁性（magnetic）4个部分，因此称为BEAMing^[21]。Klein-Scory 等^[22]对转移性结直肠癌患者69份血液中的ctDNA水平进行了分析，发现该方法的检测灵敏度可低至 0.005%。BEAMing用于检测血液中低通量的已知基因突变效果较好，缺点是价格贵、操作难度大，且成功率较低，目前临床使用率不高^[23]。

2.5.2 ddPCR

ddPCR是第三代PCR技术，在传统 PCR扩增的基础上对样本进行微滴化操作，无需参照即可实现绝对定量，突变检测线约为0.005%。 Hindson等^[24]于2011年提出ddPCR在DNA拷贝绝对定量中的应用，使该技术的使用更加规范化。与第二代PCR技术相比，ddPCR仅需极少的模板量即可进行分析，且可精准测定基因的拷贝数^[25]。Bet tegowda 等^[26]通过ddPCR对640例多个种类的癌症患者进行分析，发现75%的胰腺癌、膀胱癌、肝细胞癌患者和50%的甲状腺癌、前列腺癌患者血液中检测到 ctDNA，在对其中206例结直肠癌患者的研究中，其检测出KRAS基因突变的灵敏度为87%，特异度为99%。ddPCR的不足是仅能检测到有限的基因突变信息。

2.6 靶向深度测序技术

标记扩增深度测序指在目标区域建立引物，进行两轮扩增，为扩增产物两端加上接头和标签序列进行测序分析。

深度测序肿瘤个体化建档法通过由生物酰化的DNA寡核苷酸探针组成的“筛选器”对特定肿瘤类型的基因频繁突变区域进行特异性捕获，并将得到的样本进行深度测序。该方法的灵敏度是目前ctDNA检测中最高的^[28]。

以上两种技术可用于目标区域选定的基因突变和基因重排，灵敏度极高，但所需的样本量大，成本较高，并且此类技术对于相应的区域进行分析和运用的综合性不高。

3 循环肿瘤DNA在肿瘤中的临床应用

ctDNA来源于肿瘤细胞，其包含的基因信息能充分反映肿瘤的异质性。通过检测ctDNA的水平，可以得到肿瘤的相关基因信息。同时，ctDNA的可重复使用特性决定了它可以贯穿疾病管理的全周期，因此，在肿瘤的诊断、治疗和预后评估等方面发挥重要的作用。

3.1 ctDNA在肿瘤早期诊断中的应用

对肿瘤患者而言，传统的影像学检查、病理活检发现疾病时多已是晚期，因此，不能够早期及时诊断是影响肿瘤治疗的主要原因。在肿瘤筛查与早期诊断中，ctDNA目前被认为是液体活检中的新型生物标志物之一。研究发现，Ⅳ期肿瘤患者的ctDNA检出率为 87%，而Ⅰ期肿瘤患者的ctDNA检出率为47%^[26]。 早期干预可显著改善肿瘤患者的预后、提高生存质量。Proskurina等^[29]研究发现，结直肠癌患者早期治疗的5年存活率可高达90%，而晚期治疗的5年存活率仅为10% ～ 40%。Sun等^[30]基于58例髓母细胞瘤患者脑脊液中的ctDNA进行分析，发现KMT2D 和BCOR可能成为髓母细胞瘤早期诊断的潜在生物标志物。Zhang等^[31]将卵巢癌患者与健康人的血液样本进行对照，发现血浆ALU基因序列水平可用于该病的早期诊断。以上研究说明ctDNA是一种应用广泛，特异度和灵敏度均较高的生物标志物，可用 于不同类型肿瘤的早期诊断。

此外，ctDNA也可用于肿瘤的筛查。Yang等^[32] 证实ctDNA的检出率高于目前5种常用的肿瘤生物标志物，包括癌胚抗原、甲胎蛋白、糖类抗原125、 糖类抗原199、糖类抗原72-4。Rodriguez等^[33]发现 PIK3CA和TP53基因突变可用于乳腺钼靶分级为 BRADS-4c/5的乳腺癌筛查。由于肿瘤早期也能释放ctDNA入血液中，因此ctDNA可以检测出早期肿 瘤。Nakamura等^[34]对50例晚期胃癌患者进行基因分型，结果发现其筛查时间（11 d）明显短于传统的组织基因分型时间（33 d），这提示ctDNA在肿瘤筛查方面具有快速、精准的优势。

除基因突变外，ctDNA的甲基化水平也可作为潜在的非侵入性诊断指标用于肿瘤的早期诊断。 Bodelon等^[35]将ctDNA基因变异与ctDNA甲基化水平、肿瘤生物标志物等通过特定算法用于乳腺癌的早期诊断。Luo等^[36]通过对801例结直肠癌患者的ctDNA甲基化标志物进行分析，发现甲基化标记 cg10673833对结直肠癌的早期诊断有较高的灵敏度（89.7%）和特异度（86.8%）。Wu等^[37]认为ctDNA甲基化改变（DB2X、THY1、TGR5等）可用于肝细胞癌的早期诊断。Nesvet等^[38]结合甲基化特异PCR与熔点曲线分析对黑色素瘤细胞进行分析，可检测甲基化DNA水平低至0.1%。因此，ctDNA甲基化可作为筛查肿瘤的生物标志物，在临床应用中具有重大价值。

3.2 ctDNA在肿瘤治疗中的应用

肿瘤患者治疗后血液中ctDNA水平常常呈下降趋势。因此，ctDNA 可作为检测手术切除或放化疗效果的生物标志物。 Leal等^[39]通过对50例胃癌患者术前化疗9周和术后的ctDNA水平进行对照分析，发现58个分析基因中 有1个或多个发生突变，灵敏度为88%，TP53是突 变最频繁的基因（22%），并认为ctDNA可以用于评 估胃癌患者围手术期治疗效果和手术治疗的预后。 Sch?ler等^[40]发现复发的结直肠癌患者在术后可检出ctDNA，而未复发患者则检测不到。与传统的影像学检查相比，ctDNA检测出肿瘤复发的时间可提前约9.5个月，这充分说明ctDNA在预测病情和早期复发上具有显著优势。

原发肿瘤不同的克隆可以导致不同的基因突变，耐药性强的肿瘤细胞存活下来可以导致新的突变，这给肿瘤的治疗带来了困难。ctDNA可针对突变基因，为肿瘤患者制订个体化治疗方案，并指导靶向或免疫药物治疗。Wang等^[41]通过对56例服用曲妥珠单抗的胃癌患者进行ctDNA水平检测，发现ctDNA中HER2基因拷贝数的变化可用于检测曲妥珠单抗的疗效，曲妥珠单抗治疗有效时，ctDNA 的变化早于其他肿瘤标志物。Soria-Comes等^[42]研究发现，ctDNA中EGFR基因的显著改变可用于评估非小细胞肺癌患者在接受酪氨酸激酶抑制剂治疗后的疗效，从而指导个体化用药。Bachet等^[43]对晚期胰腺癌患者治疗前后的血液ctDNA水平进行对照分析，评估Eryaspase（L-天冬酰氨酶包埋于红细胞）对晚期胰腺癌的疗效，结果显示ctDNA水平变化与治疗效果相关，ctDNA可作为评估Eryaspase对晚期胰腺癌疗效的生物标志物。通过ctDNA去了解肿瘤，根据基因信息制订有效的治疗方案可使患者从中获益。

ctDNA包含患者的基因突变信息，不仅可对靶向药物的疗效进行预测，还可发现耐药后突变的基因。肿瘤耐药是目前治疗恶性肿瘤面临的主要问题之一，由于耐药机制复杂，利用ctDNA可以了解耐药突变的产生并寻找新的治疗靶点。Guo等^[44]对 1例接受过第一代、第二代、第三代间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）抑制剂治疗的非小细胞肺癌患者的血浆ctDNA进行测序分析，发现当患者对塞瑞替尼产生耐药时可检测到 ALKT1151Sins突变，对lorlatinib产生应答时则出现MET扩增，当患者接受克唑替尼和lorlatinib联合治疗时MET降低。这明确了ALK抑制剂对非小细胞肺癌患者耐药的作用机制，并对ALK抑制剂在该患者群中的用药提供了科学指导。

3.3 ctDNA在预后评估和复发检测中的应用

目前对于肿瘤患者的预后评估与复发检测多采用传统影像学检查结合实验室检查的方法，与传统方法相比，ctDNA具有避免辐射、减少伤害的优点，同时更具有预见性，可提前数月发现肿瘤有无进展。多项研究均显示ctDNA可用于评价手术和化疗后的疗效。Magbanua等^[45]报道了ctDNA检测预测高危乳腺癌患者接受新辅助化疗后的效果，ctDNA检测阳性的患者转移性复发的风险显著增加。Vandeputte 等^[46]发现患者的ctDNA水平与无进展生存和整体存活率呈负相关，提示ctDNA是与不良治疗效果相关的可靠预后因素。ctDNA检测结果阳性表明肿瘤患者在接受手术、放化疗或靶向治疗后，复发率高或生存期短。Chalfin等^[47]发现ctDNA与尿路上皮癌患者较差的预后显著相关（P ＝ 0.039）。Gassa等^[48] 使用ddPCR技术对24例肺癌患者的ctDNA水平进行检测，发现TP53和KRAS基因突变与肺癌的预后呈负相关。这些都说明了ctDNA对肿瘤的预后评估和复发检测有较高的特异度和灵敏度。

4 循环肿瘤DNA在临床应用中的挑战

ctDNA作为一种新的肿瘤标志物，能很好地反映肿瘤信息，虽然目前无法代替病理活检这一金标准，但其较高的特异度和灵敏度可作为肿瘤诊断的补充手段，特别是对于临床症状不明显、无法行病理活检的肿瘤患者。 然而，ctDNA检测技术当前仍面临一些需要解决的难题。ctDNA无法提供肿瘤的全部信息，有研究显示，ctDNA有时与病理活检结果不一致，在一些健康人的血液样本中也可检测出ctDNA^[49]。对于不同种类、不同进展阶段的肿瘤，ctDNA的采集、 提取和扩增并没有标准化流程，对少见变异的临床界定也需大量临床信息积累。此外，ctDNA的成本问题也会阻碍其走向临床应用^[50]。ctDNA水平也可能因炎症反应和药物刺激而出现波动，而且目前大多数ctDNA研究多集中于高水平ctDNA的晚期恶性肿瘤，缺少对早期肿瘤和低水平ctDNA的相关研究经验^[51]。以上均是目前ctDNA检测分析面临的挑战。目前全球仅有6款ctDNA检测试剂盒获批，中国已有3款试剂盒获批使用，但仅用于大肠癌的早期筛查。商业检测机构倾向于开发NGS技术对肿瘤进行分析^[52]，但多技术、多指标的联合可以更精准地解读肿瘤类型。例如Girroti等^[53]通过联合基因测序、ctDNA检测及CTC检测建立了一个黑色素瘤临床管理平台，为该患者群体提供精准治疗。同时 ctDNA的检测应缩短耗时，Carvalho等^[54]使用一种快速检测系统，0.5 h即可从血浆中提取出ctDNA。

5 总结

随着对肿瘤研究的进展，多项研究均表明ctDNA 检测具有临床应用潜能。ctDNA具有特异度和灵敏度较高、可动态监测、可详细反映肿瘤基因信息等优势，为诊断困难的患者提供了肿瘤基因检测的途径， 协助医生做出精准判断，并指导用药和精准治疗， 也为肿瘤预后和复发检测提供了方便的途径。然而 检测成本高、检测时间长、无固定的标准流程仍限制着ctDNA的应用，相信随着这些难题的解决，ctDNA 检测在未来可能成为肿瘤诊疗中不可或缺的手段之一。