游离胎儿DNA检测技术

由《中华妇产科杂志》编委会主办、北京协和医院和浙江大学医学院附属妇产科医院共同承办的“2012年产前分子诊断新技术专家座谈会”于2012年4月14日在杭州召开，邀请的专家有北京协和医院边旭明、刘俊涛教授，浙江大学医学院附属妇产医院黄荷凤、贺晶、吕时铭教授，中南大学湘雅医学院医学遗传学国家重点实验室邬玲仟教授，南京大学医学院附属鼓楼医院胡娅莉教授，四川大学华西第二医院王和教授，河南省人民医院廖世秀教授，解放军总医院卢彦平教授，云南省第一人民医院朱宝生教授，南京市妇幼保健院许争峰教授，广州市妇女儿童医疗中心廖灿教授，中山大学附属第一医院方群教授，以及旁听会议的朱宇宁等数位中青年产前诊断学者共计25位。游离胎儿DNA检测技术是这次会议的热点和重点。

以下从背景、研究结果、技术特点、专家观点等4个方面分别进行阐述。

1．背景：自1997年香港中文大学Dennis Lo教授发表了妊娠期间孕妇血浆中含有胎儿细胞及胎儿DNA的研究结果以来，通过孕妇血浆中胎儿细胞及游离胎儿DNA进行各种胎儿染色体病的产前筛查和产前诊断成为备受关注的研究热点。现有的研究已经明确，整个孕期在孕妇的外周血中长期稳定地存在着大量来自胎儿的游离DNA片段，孕4周左右就能从孕妇外周血中检出，孕7周建立胎儿胎盘循环后游离胎儿DNA以一定的比例稳定存在于孕妇外周血中。游离胎儿DNA在孕妇外周血浆中以75-205 bp的小片段形式稳定存在，占血浆中全部游离DNA的5％-30％，比例随着孕周的增大而缓慢上升。如果胎儿为21三体患儿，则孕妇血浆中来自于胎儿21号染色体的游离片段会有50％的升高，并引起外周血中全部21号染色体来源的片段数量微量增加。要准确快速地检测这种微量拷贝数的改变，需要高通量、大规模测序技术的支撑。随着2010年以来新一代测序技术—大规模平行测序技术(MPSS)的成熟，上述瓶颈得以突破，MPSS首先在2l三体的产前筛查和产前诊断方面显示出明显的技术优势，并迅速向临床转化。目前，在该领域已经建立起比较成熟的针对21三体、18三体和13三体的母血中游离胎儿DNA检测及分析预测技术。迄今，美国已有4家公司进行商业化的临床应用，而在中国大陆地区也有两家公司从事这方面的技术应用和开发工作，并在国内一线城市进行了较大规模的市场推广活动。

2．研究结果：Ehrich等采用第二代测序技术对孕妇外周血浆中游离胎儿DNA进行无创性胎儿21三体检测，共对480例高危孕妇进行检测，结果显示，对21三体检测的敏感性为100.O％，特异性为99.7％。2012年，Palomaki等采用不同的计算方法，采用第二代测序技术对孕妇血浆中游离胎儿DNA进行检测，对18三体和13三体的检出率分别为100.0％和91.7％，假阳性率分别为0.28％和0.97％。同时，美国妇产科医师协会(ACOG)进行的一项多中心研究评价了MPSS对孕妇血浆全基因组范围胎儿非整倍体诊断的准确性，结果显示，2l三体的敏感性为 100.0％，18三体的敏感性97.2％，13三体的敏感性78.6％，这项最新的前瞻性研究证实了对孕妇血浆中游离胎儿DNA采用第二代高通量测序技术及优化计算方法对全基因组范围内胎儿多条染色体非整倍体有非常好的检出率。北京协和医院完成的一项对2241例以低危为主的孕妇人群进行游离胎儿DNA检测研究的结果，其中对于21三体、18三体、13三体的检出率均为100％，有1例18三体假阳性，总体假阳性率为0.5％，总体标本检测失败率为5％。

3．技术特点：

(1)对于目标疾病有高的检出率和低的假阳性率。该技术对于21三体等常见染色体非整倍体异常总体检出率在99％以上，假阳性率在0.1％左右，大大优于目前产前筛查的效率。

(2)筛查的孕周范围大。该筛查技术可以应用于早孕期9周以后和中孕期，甚至孕23周以后至足月，大大扩大了允许筛查的孕周范同。

(3)临床所需信息少，取材便捷，流程较简单，质量控制相对容易。该技术用于胎儿疾病风险计算所需要的相关临床信息很少，临床操作简单易行。

(4)技术有后续进一步发展的空间。从技术原理看，胎儿的其他染色体三体异常、性染色体数目异常、染色体微缺失综合征及各种基因病都可能通过类似的技术得到产前高准确性的预测，但目前还需要测序深度、通量、成本及后续生物信息分析算法等多方面的改进后才能实现临床应用。

(5)由于该技术的假阳性率极低，可以有效降低需要产前诊断的病例数量，从而解决产前诊断技术力量不足的问题。

该技术还存在多种局限，包括：

(1)筛查的目标疾病尚偏少(目标疾病仅为2l三体、18三体、13三体)，缩小了后续产前诊断的疾病范围。

(2)双胎或多胎、嵌合体及父母中存在染色体异常的病例均不适于采用该技术进行筛查。

(3)检测费用较昂贵，目前国内许多地区收费高于3000元／例，从全国整体层面及经济角度看，大多数的孕妇还无法承受，不能有效解决我国当前的整体产前筛查和产前诊断的需求。

(4)目前，由于该技术的专业化程度较高，各医疗机构的产前诊断实验室尚无法独立开展，需要与商业公司合作，从而存在医疗风险界定的问题。

(5)该技术迄今尚未取得食品药品监督管理领域的临床体外诊断应用许可，也还未经过产前诊断技术准人，若有相关医疗纠纷出现，不利于该技术的健康发展。

4．专家观点：

(1)游离胎儿DNA检测技术应用的目标疾病及技术定位：与会专家通过充分的讨论一致提出，游离胎儿DNA检测技术在目前发展阶段的目标疾病应该明确在胎儿2l三体、18三体和13三体综合征，临床应用宜定位于“近似于产前诊断水平的”、“目标疾病指向精确的”产前筛查技术。主要的理由有以下几点：

①国内外会议中公布的多个临床研究结果已经充分证实了该技术用于21三体、18三体、13三体产前筛查有良好的临床有效性（21三体检出率97％，假阳性率0.3％左右）；

②这些研究中都存在2l 三体、18 三体、13 三体和性染色体异常检测的假阴性病例和检测失败的病例(2％一5％)；

③这些研究提示，性染色体异常无创性诊断的符合率较低(约25％)；

④从技术角度分析，双胎或多胎、嵌合体及父母中存在染色体异常的病例均不适于进行游离胎儿DNA检测分析，该部分病例约占所有病例的5％；

⑤该技术由于发展过程的局限性，现阶段对于其他染色体三体异常、结构异常及微缺失综合征尚缺乏有效的筛查指示作用，对于三体异常与非平衡性易位也无法区分。

(2)临床应用的适应证和禁忌证：

临床应用适应证有：

① 有介人性产前诊断禁忌症者(先兆流产、发热、出血倾向、感染未愈等)；

② 产前筛查临界高风险孕妇(如风险率在1／270～1／1000)；

③ 珍贵儿妊娠，知情后拒绝介入性产前诊断的孕妇；

④ 对介人性产前诊断极度焦虑的孕妇；

⑤无法预约到产前诊断的孕妇。

禁忌证：

① 产前B超检查异常的孕妇；

② 双胎或多胎孕妇；

③ 夫妇双方之一有明确染色体结构或数目异常的孕妇；

④ 胎儿疑有微缺失综合征、其他染色体异常或基因病的孕妇；

⑤接受过异体输血、移植手术、干细胞治疗、免疫治疗的孕妇。

边旭明教授提出了如下的总结性意见，得到了绝大多数专家的赞同：

1．游离胎儿DNA检测技术是现行的产前筛查和产前诊断体系的有效补充。

2．目前，该技术宜定位于2l三体、18三体、13三体的产前筛查领域，与传统的超声及血清学筛查技术并不冲突。

3．目标疾病、适应证和禁忌证的确定以及完善行政许可审批，是该技术当前需要解决的主要问题。

4．呼吁适时开展全国多中心大样本的相关课题研究，全面客观评估该技术的特点，总结该技术与现有产前筛查模式和产前诊断体系的结合模式，以进一步提出适合中国国情的综合应用指导意见。

摘自《2012年产前分子诊断新技术专家座谈会纪要》，《中华妇产科杂志》,第47卷第11期,804-807页，2012年.