胃癌分子分型研究进展

刘静文 综述 刘红利 张涛 审校

华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心（430022）

通讯作者：刘红利whliuhongli@163.com

【摘要】 胃癌是发病率及致死率较高的一种恶性肿瘤。胃癌的病理分型是以组织形态结构和细胞生物学特性为基础, 不同类型的胃癌, 其形态结构和生物学行为各异, 流行病学和分子机制亦不同, 以致现有的胃癌病理分型系统众多。以往常用的病理分型包括：Borrmann分型、Lauren分型和WHO分型。已有的这些胃癌分型对临床指导意义有限。最新的研究对295例胃癌进行综合性分子分析，这是癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas TCGA）计划工作的一部分，基于对所得数据的分析整合，提出了一种新的胃癌分子分型，将其分为四个亚型：EBV感染型；微卫星不稳定（microsatellite instable MSI）型；基因组稳定（genomically stable GS）型；染色体不稳定(chromosomal instability CIN)型。该研究于2014年7月23日在《nature》在线发表，新发现的胃癌分子分型有助于胃癌个体化治疗靶向药物的筛选。本文将对胃癌的分子分型研究展开综述。

【关键词】胃癌；分子分型；EBV感染型；微卫星不稳定；基因组稳定型；染色体不稳定型

Research Progress of Molecular Type of Gastric Cancer

Liu Jingwen，Liu Hongli.Cancer Center，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430023，China

Corresponding author：Liu Hongli,E-mail:whliuhongli@163.com

【Abstract】 Gastric cancer is a kind of malignant tumor which has higher incidence and mortality rate. Its pathological type is based on the morphological structure of tissue and cell biological characteristics. Not only morphological structure and biological characteristics but epidemiology and molecular mechanism is also different for each type, which makes so many typing systems coming out. Usual pathological types include: Borrmann type, Lauren type and WHO type. All these types have limited significance for clinic. The latest research analyzed 295 primary gastric carcinomas at comprehensive molecular stage, which is also a part of TCGA (The Cancer Genome Atlas) project. Ultimately, they put forward a new typing system which divided gastric cancer into four types including tumor positive for Epstein-Barr virus (EBV), microsatellite instable(MSI) tumors, genomically stable(GS) tumors and tumor with chromosomal instability (CIN). The study is published in the ‘nature’ online in july 23,2014, which contribute to targeted drug screening of individualized treatment of gastric cancer. This paper is going to review the development of gastric cancer molecular type.

【Key words】gastric cancer; molecular type; tumor positive for Epstein-Barr virus (EBV); microsatellite instable(MSI) tumors; genomically stable(GS) tumors; tumor with chromosomal instability (CIN)

目前，全球每年新发胃癌100 余万例，中国占42%，死亡70余 万例，中国占35%。胃癌已成为世界第三大致死癌种，在中国和日本尤为高发^[1]。以往常用的病理分型包括：Borrmann分型、Lauren分型和WHO分型。这几种分型均是在组织形态结构和细胞生物学特性的基础上进行。

1923年德国病理学家Borrmann提出一种胃癌大体形态分型方法, 称为Borrmann分型。此分型主要根据癌瘤在黏膜面的形态特征和在胃壁内的浸润方式进行分类, 将胃癌分为4 型：Ⅰ型( 结节型)，Ⅱ型(溃疡局限型)，Ⅲ型( 浸润溃疡型)，Ⅳ型( 弥漫浸润型)，IV型胃癌胃壁呈广泛增厚变硬, 又称“革囊胃”。 1965年Lauren根据胃癌的组织结构和生物学行为, 将胃癌分为肠型和弥漫型, 后来称为Lauren分型^[2]。WHO于1979年提出以组织来源及其异型性为基础的国际分型。该系统将胃癌分为腺癌(乳头状腺癌、管状腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌)、腺鳞癌、鳞状细胞癌、类癌、未分化癌和不能分类的癌。1990年WHO对胃癌组织分型进行修改, 新的标准将胃癌分为上皮性肿瘤和类癌两类, 上皮性肿瘤包括腺癌( 乳头状腺癌、管状腺癌、低分化腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌)、鳞腺癌、未分化癌和不能分类癌。然而这些分型系统临床意义小，均不能对临床个体化治疗提供有效治疗靶点，这使我们迫切的需要寻找一种新的分子分型方法，为胃癌个体化治疗靶向药物的筛选提供依据。

研究表明，大多数胃癌与感染因素有关，包括幽门螺杆菌（Helicobacter pylori H.pylor）^[3]和EB病毒（Epstein-Barr virus EBV）感染^[4]。少部分胃癌与E-钙黏蛋白基因（CDH1）^[5]或错配修复基因（Lynch syndrome）种系突变有关，少数错配修复缺陷胃癌不表达CIMP（CpG island methylator ohenotype）中的MLH1^[6]。基于以上相关研究，已有人用基因表达谱或DNA序列来描述胃癌的分子特征，但尚未形成一个明确的分子分型系统。

2014年7月23日在《nature》在线发表的一篇论文引起研究人员的广泛关注。作为癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas TCGA）计划工作的一部分，研究者收集了295例未接受过放化疗的原发性胃癌患者组织和血液标本，采用6种分子平台对样本进行分析，包括：①成组体细胞拷贝数分析；②全外显子序列分析；③成组DNA甲基化程度分析；④mRNA序列分析；⑤miRNA序列分析；⑥成组反相蛋白分析（reverse-phase protein array RPPA）。77%的样本均进行了以上6种分子平台的检测，全部样本DNA进行了MSI检测，107例样本进行了低通量全基因组测序。通过大量检测结果计算，基于对所得数据的分析整合，提出了一种胃癌分子分型，将其分为四个亚型：①EBV感染型，其特征包括PIK3CA频发突变、DNA超甲基化和JAK2、CD274和PDCD1LG2扩增；②MSI型，其特征是高突变率，包括编码癌基因信号通路蛋白的激活性基因突变；③GS型，其特征包括：该型多发生于组织学弥漫型中，有RHOA突变或RHO家族GTP酶活化蛋白基因融合现象；④CIN型，其具有标志性的异倍染色体和受体酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinases RTKs）原位扩增^[7]。

1 EBV（Epstein-Barr，EBV）病毒阳性型

EBV型约占9%，好发于胃底和胃体，多见于男性^[8]。研究分别采用mRNA、miRNA、外显子和全基因组序列分析来证实EBV感染，得到了高度一致的结果。相反，仅检测到极少量H.pylori感染证据，这说明细菌感染在促进慢性胃病发展为癌的过程中所起作用不大。检测非配对肿瘤样本CpG甲基化水平显示，EBV型有丰富的CIMP^[9]，这与之前的研究结果一致^[10]。EBV-CIMP和MSI相关胃-CIMP中甲基化情况的不同反应了各亚组突变谱和基因表达的不同。EBV型的DNA超甲基化水平比任何TCGA报道过的肿瘤都要高。EBV型都有CDKN2A（p16^INK4A）启动子超甲基化，。CDKN2A是细胞周期依赖性激酶抑制基因，为一种重要的抑癌基因，其启动子发生甲基化后会导致基因不表达，促进肿瘤发生。但该型缺乏MSI相关CIPM的特征性MLH1启动子超甲基化^[11]

EBV型中多有PIK3CA突变^[12,13]，80%EBV型发生了非无义PIK3CA突变，且其突变位点非常弥散。相反，其它亚型中只有3%~42%的PIK3CA突变，且突变多集中于编码激酶的外显子20处。因此，抑制PI3K可用来证实EBV型的这一特征^[7]，并有可能成为该型的治疗靶点。此外，EBV型多有ARID1A（55%）和BCOR（23%）突变，缺乏多见于CIN型的TP53突变。ARID1A为一种抑癌基因，其突变与多种肿瘤（如卵巢癌、肝癌、胃癌和乳腺癌等）的发生相关。BCOR编码一种抗凋亡蛋白，在白血病和髓母细胞瘤中同样可见其突变^[14,15]。

研究发现了一个新的频发扩增位点，位于染色体9p24.1，包括JAK2，CD274和PDCD1LG2扩增。该扩增多发生于EBV型^[7]。JAK2编码一种RTK，是潜在的治疗靶点^[16]。和PDCD1LG2分别编码免疫抑制蛋白PD-L1和PD-L2，并可能成为抗肿瘤免疫应答的治疗靶点。CD274扩增与EBV阳性淋巴样肿瘤中有PD-L1高表达相一致^[17,18]。以上研究结果提示PD-L1/2拮抗剂和JAK2抑制剂可能对EBV型治疗有益。

基于以上研究结果，PIK3CA高频突变提示PI3K抑制剂可能对EBV型有独特的疗效。ARID1A和BCOR频发突变提示其编码蛋白拮抗剂均可能成为此型患者的新靶向治疗药物。此外，受体酪氨酸激酶JAK2和免疫抑制蛋白PD-L1/2的过表达提示JAK2拮抗剂和以增强抗肿瘤免疫反应为靶点的PDL1/2拮抗剂也可能成为此型胃癌患者的治疗新选择。

2 微卫星不稳定（MSI）型

MSI型约占22%，好发于胃窦或幽门，多见于女性（占56%），初诊年龄偏高（中位年龄72岁）。该型有DNA超甲基化和高突变率。DNA超甲基化包括MSI相关胃型-CIMP及特征性MLH1启动子的超甲基化，后者可导致DNA错配修复蛋白MLH1沉默表达^[7，19]。由于DNA修复机制异常而导致了DNA高突变率，包括多种能激活致癌信号蛋白的基因突变，如PIK3CA、ERBB3、ERBB2和EGFR突变。虽然在MSI型结直肠癌中发现了BRAF V600E基因突变，并进一步研发出了相应的靶向药物，且在临床上已显示出良好的疗效^[20]，但在MSI型胃癌中并未发现该突变。此外，用HotNet分析MSI型的基因突变显示在I类组织相容性复合物基因中有相同的改变，包括B2M和HLA-B突变。在结直肠癌和黑色素瘤中，B2M突变会导致I类HLA复合物表达缺失^[21]，以上说明这类突变可通过减少抗原呈递而导致肿瘤免疫逃逸。

据以上研究，MSI型缺乏可靶向的基因扩增，但具有高频DNA突变率，未来的研究重点将在于从众多的基因突变中筛选出可靶向抑制肿瘤的特征性基因突变，并探索出相应的靶向治疗策略。

3 基因组稳定（GS）型

GS型约占20%，初诊年龄偏低（中位年龄59岁），多属Lauren分型中的弥漫型（73%）。GS型多有CDH1突变（37%）、RHOA突变或RHO家族GTP酶活化蛋白基因融合现象（CLDN18-ARHGAP融合）^[7]。此前认为CDH1种系突变与遗传性弥漫型胃癌（hereditary diffuse gastric cancer HDGC）密切相关^[22]。但是，在基因种系分析中仅揭示了两种CDH1多态性，且都不为HDGC的病因。RHOA突变是GS型的特征性突变。当RHOA处于GTP结合的活化态时，能通过多种效应因子（包括ROCK1、mDIA和PKN）调节肌动-肌球蛋白依赖的细胞收缩和移动^[23,24]，并激活STAT3通路促进肿瘤发生^[25,26]。当发生RHOA突变时， RHOA与ROCK1等效应因子相接触的两个临近的氨基末端结构域会发生改变。RHOA的突变位点并不类似于癌基因突变发生在RAS家族GTP酶处。尽管有一例发生了密码子17突变，但我们并没有发现G17V的显性负突变，该显性负突变在T细胞恶性肿瘤中有发生^[27,28]。RHOA突变能改变RHOA的下游信号通路。RHOA Y42C突变减弱了PKN的活化，但对mDia或ROCK1无影响^[29]。有5例样本发生了RHOA Y42突变，该突变正如HRAS上的Y40，Y40的基因发生突变能选择性的减弱HRAS对RAF的活化，而对其它RAS效应因子无影响^[30]。以上均说明，RHOA在细胞运动方面具有重要作用，RHOA的改变会导致肿瘤呈分散性生长并使细胞缺乏粘附性，这些均是弥漫型胃癌的标志。

对频发性结构基因改变的分析进一步显示了GS型中RHO通路的重要性，这些改变包括两例发生于染色体间的CLDN18和ARHGAP26(GRAF)易位。ARHGAP26是一种GTP酶活化蛋白（GTPase-activating protein GAP），能使RHO GTP酶转化为GDP态，加强细胞移动^[31]。CLDN18是细胞紧密连接结构的组成部分^[32]。此外，还发现了9例CLDN18-ARHGAP26融合，2例CLDN18-ARHGAP6（编码同源GAP）融合现象。该类融合发生在CLDN18外显子5的终止密码子之前，为有义融合，导致CLDN18胞质部分羧基末端连接有ARHGAP26或ARHGAP6大片段，该嵌合蛋白保有ARHGAP26/6羧基末端GAP结构域，潜在的影响了ARHGAP对RHOA通路的调节作用。同时，该融合现象也影响了CLDN18介导的细胞黏附作用。CLDN18-ARHGAP融合与RHOA突变不会同时出现，其在GS型中发生率共占62%。以上研究结果开启了全新的研究视角，有望为这类致死性较高的胃癌亚型带来新的治疗选择。

4 染色体不稳定（CIN）型

CIN型约占50%，多发生于胃食管交界处和贲门（65%），多属Lauren分型中的肠型。CIN型多为染色体异倍体。更具临床意义的特征是，几乎所有RTKs都有基因扩增，其中许多已能被现有的或研发中的药物所阻断^[7]。 该型多有EGFR扩增所致的EGFR磷酸化水平升高更具特征性的是，，抗血管生成作用明显，靶向VEGFR2的抗体ramucirumab对此型胃癌可显示出抗肿瘤作用，但其疗效是否由VEGFA基因扩增决定尚需进一步的研究证实^[33]。此外，细胞周期调节基因（CCNE1、CCND1和CDK6）频发扩增提示其可能成为抑制周期素依赖激酶的潜在治疗靶点^[34]。

总结：

在日益提倡癌症个体化治疗的时代，现有的胃癌组织病理学分型已难以适应临床诊疗的需要。基于对胃癌分子和基因层面的特征分析，通过对现有MSI和EBV的检测以及最新的基因组分析法的使用，找到集中的突变和扩增基因集，进而对胃癌进行分子分型,提出了一个新的分子分型法将胃腺癌分为四型：EBV感染型、MSI型、GS型和CIN型。该分型法是对组织病理分型有效补充。这些分子亚型显示出特有的基因组特征，从而对靶向治疗的选择和临床实验中胃癌病人的分组具有指导性的意义。此外，RHOA突变同样见于亚洲胃癌患者，这为今后中国胃癌分子分型研究带来希望。希望这些结果将有助于以探索特定类型患者治疗的临床实验的发展，并最终提高疾病的生存率。

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