诱导多能干细胞及在心血管方面研究进

一．iPS细胞的发现及研究历程

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,IPS细胞）是通过将转录因子导入已分化的体细胞中重编程形成的，和胚胎干细胞类似，具有广泛的全能性，所不同的是诱导多能干细胞不需要通过胚胎组织产生，因此避免了伦理道德问题。更重要的是诱导多能干细胞具有多组织分化潜能，能在体外分化成所有三胚层细胞，因此在临床医学、再生医学领域都有广泛的应用。IPS细胞从产生至今日，一直受到科学家的广泛关注，近年来科学家们致力于研究如何更有效、更安全的产生诱导多能干细胞，并取得了重大的进展。2012年10月，山中伸弥博士凭借在IPS领域做出的巨大贡献获得了诺贝尔生理或医学奖。

2006年，日本科学家Yamanaka【1】研究小组首次发现将4 种转录因子Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4转入小鼠成纤维细胞，可获得具有全能性的诱导多能干细胞。2007年，山中伸弥【2】小组将四种因子转入人体细胞中重编程为诱导多能干细胞。

2007年12月，2007 年12 月, Thomson 等【3】筛选出了另外一套用于诱导的基因组合—Oct4、Sox2、Nanog 和Lin28。随后, 他们利用这4 种因子使人类新生儿成纤维细胞重编程为iPS 细胞【3】。这两项发现分别被《自然》和《科学》杂志评为2007 年第一和第二大科学进展。

2008 年4 月, Schenke-Layland 等【4】将鼠皮肤细胞重编程为iPS 细胞, 并成功地使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。

2009 年2 月, 日本东京大学研究人员在培养iPS细胞的时候添加人类骨髓细胞以及催进细胞增殖的蛋白质等物质使iPS 细胞分化成了血小板的前身巨核细胞, 进一步培育出血小板, 同时也从技术上说明了用iPS 细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的。

2009 年3 月, iPS 细胞研究相继迎来两项重大突破。3 月1日, Nagy 研究组和Kaji 小组[5, 6]采用转座子介导的方法高效率制备了virus-free 鼠iPS 细胞,获得iPS 细胞后, 又成功将先前导入的转录因子基因从iPS 细胞中移除。3 月6日, Jaenisch 小组[7]将移除外源基因的人iPS 细胞成功诱导成多巴胺神经元, 且神经元细胞的基本功能不受影响。

iPS细胞产生大致步骤：

（1）分离和培养宿主细胞（2）将几个重要的全能性因子通过病毒转染的方式导入宿主细胞（3）将病毒转染的细胞在ES培养体系中培养，并在培养液中加入小分子化合物促进重编程（4）出现ES样克隆后进行iPS细胞的鉴定（细胞形态，表观遗传学，全基因表达谱，全能性等方面）目前获得iPS细胞的技术已经成熟，科学家们已经从多种动物的的体细胞中诱导产生了iPS细胞。

二．iPS细胞安全性的提高

科学家们在制备iPS细胞过程中发现，全能性相关基因c-Myc具有致癌作用，这使得iPS细胞的应用受到限制。2009 年10 月，丁盛博士［8］针对iPS 细胞的潜在危害问题，建立了一种诱导多功能干细胞的新方法。他利用纯化的蛋白将成体细胞转化为最原始的胚胎样细胞，从而避免了插入基因带来的危害。2012 年，Yamanaka研究小组发现，用与c-Myc基因结构类似的基因L-Myc来替代c-Myc基因，同其它三个基因一起用病毒转染的方式导入宿主细胞，同样可以获得iPS细胞，继续培养，使iPS细胞分化为生殖细胞，并培育出实验小鼠，且几乎没有发现肿瘤，另外iPS细胞的诱导效率提高了将近三倍。这一报道对提高iPS细胞诱导效率以及解决iPS细胞发育成癌细胞的问题具有重要的意义。现在经过各国科学家的不懈努力，研究出更多、更安全、更有效的产生iPS细胞的方法，使用的因子越来越少，有的甚至只需要小分子化合物就足以产生iPS细胞，虽然转化效率有待提高，但是其安全性及便利性有目共睹。

三．最新iPS细胞的诱导方法

在早期的研究当中，人们通常利用逆转录病毒为载体将四因子导入分化细胞，但是，这种方法很有可能导致外源基因插入细胞的基因组中，引起插入突变，存在很大的弊端。因此，人们开始尝试利用其他小分子基因转染的方法。Stadtfeld等【9】利用腺病毒载体成功诱导了小鼠iPS细胞的产生，Okita等【10】利用脂质体转染的方法建立了小鼠的iPS细胞，Huangfu等【11】发现在诱导人iPS细胞过程中，可以用一种小分子物质代替以往使用的一种癌基因，即只需要转染两个基因就可以成功得到iPS细胞。这三种无需逆转录病毒载体诱导iPS细胞的策略避免了使用逆转录病毒载体所带来的基因插入、整合、突变等问题。另外一些研究发现，一些细胞如小鼠的神经干细胞和神经前体细胞，其本身高表达Sox2,c-Myc和Klf4，因此可以只用Oct4和Klf两种转录因子，甚至只用Oct4一个转录因子就可将其重编程成iPSCs【12-14】。最近邓宏魁组【15】报到，仅仅用七种小分子化学物质诱导出了iPS细胞。他们先前发现使用“VC6T”【VPA,CHIR99021(CHIR), 616452,Tranylcypromine】和Oct4（6）可以促进重编程，之后在筛选了10000个小分子化合物后，确定了Forskolin(FSK), 2-methy-5-hydroxytryptamine (2-Me-5HT), and D4476能够替代Oct4，因此仅仅加入这七种化学物质即（VC6TF）可产生一些GFP阳性的克隆细胞，且能够表达钙黏蛋白，但是并没有产生iPS细胞。在加入DZNep之后，出现了iPS细胞，之后他们发现四种小分子物质【15】在诱导产生iPS细胞过程中是非常关键的，这四种物质(C6FZ)包括：CHIP(C),616452，FSK(F)和DZNep(Z)。

四．提高iPS细胞的重编程效率的方法

在最初的研究中，iPS细胞的重编程小效率只有0.01%左右【1】；其他一些研究中重编程的效率更低，有的甚至还不到0.001%。在提高iPS细胞安全性的一些方法中往往会伴随着重编程效率的下降，因此提高iPS细胞重编程的效率是非常重要的一点。

1 选择合适的供体细胞和不同的转录因子

不同类型的细胞分化潜能不同，因此重编程的诱导反应也不同。选择合适的细胞来进行诱导能够提高重编程效率。用逆转录病毒介导表达Yamanaka因子，人幼年角质形成细胞获得iPS细胞的效率比成纤维细胞建立iPS细胞的效率高至少100倍，且出现克隆的速度也提高了2倍【16】。Suna等【17】发现脂肪干细胞以Yamanaka因子重编程的效率能达到0.2%，是同等条件下批复成纤维细胞的20倍。Li等【18】的研究中羊水细胞中的一部分特殊细胞类群在病毒介导的Yamanaka因子诱导下克隆形成率最高可达1.525%，且第四天就出现了iPS细胞克隆。

不同因子的优化、组合也能提高重编程效率，也可配合使用其他相应的因子。Liao等【19】用Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、c-Myc和Klf4等6个转录因子转染细胞可提高重编程效率10倍左右。Mali等【20】将SV40大T抗原基因与Yamanaka因子共同感染人成体纤维细胞和胎儿成纤维细胞，可以将重编程效率提高23-70倍。而同时导入UTF1因子和下调p53表达水平的RNAi可增加Yamanaka因子重编程效率近100倍【21】。

2 影响表观修饰或者信号转导作用

在获取iPS细胞时，配合转录因子使用一些小分子化合物、蛋白质常能提高重编程效率，这是目前提高重编程效率较常用的方式。这些物质大致可以分为两种：影响表观遗传修饰的小分子化合物、蛋白质等，以及影响信号转导通路的小分子化合物。它们的作用体现在两个方面:一是提高重编程效率，二是替代某些转录因子。

组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX-0129可替代Oct4，并与其余三个Yamanaka因子一起重编程神经干细胞形成iPS细胞。此外，还可提高Oct4和Klf4两个因子重编程神经干细胞的效率【22】。此外还有很多提高重编程效率的化合物，例如BayK8644【23】可补偿Sox2的缺失带来的影响，在重编程过程中使用组蛋白去乙酰化抑制剂VPA，即使只是用Oct4和Sox2两个因子，也可把人成纤维细胞重编程为iPS细胞，不仅如此，VPA还能提高Yamanaka因子重编程小鼠成纤维细胞的效率至10%左右。另外，Esteban等【24】发现，在培养皿中添加维生素C可使iPS细胞重编程效率提高10倍，Yamanaka小组【25】发现，把培养环境的氧浓度从21%降到5%，人体皮肤细胞的重编程效率可提高到原来的2.5倍4.2倍。

五．iPS细胞的筛选

最初，Yamanaka小组用Fbx15作为筛选iPS细胞的报告基因，虽然它在小鼠ES细胞和早期胚胎中有着非常特异的表达，但是通过这种筛选策略得到的细胞在基因表达模式和DNA甲基化模式上都与ES细胞有所不同，且无法产生发育到期的嵌合小鼠。之后Yamanaka小组【26】

以及Maherali【27】和Wering【28】等人利用基因重组技术建立了具有药物抗性基因的小鼠成纤维细胞，这些细胞的抗性受内源性Nanog或Oct4表达的调控，Wering等人比较了Nanog和Oct4的筛选效果，发现利用Oct4选出的抗性细胞比利用Nanog选出的细胞在数量上少很多，但前者中获得ES细胞特性的细胞比后者多，这一结果提示，在作为评判多能性的标准方面，Oct4的激活比Nanog的激活更为严格。

六．iPS细胞研究所面对的问题

iPS细胞的出现给干细胞研究领域带来了新的理念和技术，在再生医学有广泛的应用价值，然而我们还有许多未解决的问题，限制着iPS细胞的临床应用。

仅仅几个因子的的导入是如何能够诱导体细胞发生重编程而具有多能性？为何iPS细胞的产生效率如此低？iPS细胞为何能够实现正常的分化等等。

七．iPS细胞研究应用的前景

从iPS细胞首次在动物中诞生，到建立方法的逐渐完善，再到iPS细胞研究在人类细胞中获得成功，最后到iPS细胞应用于疾病模型动物的治疗，整个过程只用了短短一年半的的时间。今后，iPS细胞的研究会成为生命科学领域的一个重要方向，随着技术的不断进步，相信iPS研究的进展会比人们想象中更为迅速。现在，我们从iPS细胞上看到了它为人类疾病治疗所带来的希望和契机，我们期望，iPS细胞所面对的的问题会在不就得将来得到解决，最终有望真正用于造福人类健康。