BMSCs促进糖尿病溃疡创面愈合的研究现状

BMSCs促进糖尿病溃疡创面愈合的研究现状

解放军第309医院 整形美容烧伤修复中心，北京 100091

郑淑娟 贾赤宇

摘 要：目前，糖尿病溃疡已成为皮肤外科临床的棘手问题。虽然进行了多年的研究和探索，但进展有限。近年来，骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）对于糖尿病溃疡的作用越来越引起大家的关注。现将BMSCs治疗糖尿病溃疡的相关研究现状进行总结和分析。

关键词：BMSCs，糖尿病溃疡，成纤维细胞

The research of bone marrow-derived mesenchymal stem cells promote healing of the ulcer of diabetic

Zheng Shujuan, Jia Chiyu

Center of plastic ＆ burns and wound repair, 309 Hospital of PLA, Beijing 100091

Abstract: Currently, diabetic ulcer has become a thorny issue of clinical surgery. Despite we are researching and exploring for many years, the progress is limited. In recent years, the role of bone marrow-derived mesenchymal stem cells(BMSCs) in the treatment of diabetic ulcer cause our attention. Now, the treatment of diabetic ulcer and the related research about BMSCs should be analysised.

Keywords: BMSCs, diabetic ulcer, fibroblasts

长期以来，糖尿病溃疡创面延迟愈合是令人难以解决的问题，随着糖尿病患者人数不断增长，糖尿病溃疡的发生率不断上升，其中糖尿病下肢溃疡尤其是糖尿病足的患者与日俱增，其治疗方式较为局限，手术虽然能解决部分问题，但疗效仍不大稳定，结局难以令人满意。而且部分患者受基础疾病或经济方面的影响，难以承受手术。是否可通过非手术治疗方法来解决这一临床问题？不少学者提出干细胞修复创面的理论，理由是BMSCs来源丰富、分离培养容易、增殖分化能力强，在适宜培养条件下易分化为组织修复细胞，利用其修复创面也成为理想的种子细胞^［1］。现就这方面现状做一综述。

1. BMSCs的概况

BMSCs来源于中胚层，是骨髓中非造血干细胞的另一类重要干细胞，有很强的自我复制和多向分化的潜能，可产生不同表型的子代细胞，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，容易获得，便于体外增值培养。且具有免疫原性小，同种异体移植BMSCs后无排斥反应或反应较弱，不涉及伦理道德等特点，因而被认为是理想的种子细胞^[2]。国外许多研究结果证实，BMSCs可以分化为多种不同类型的细胞，包括成纤维细胞、骨和软骨、肌肉（骨骼肌和平滑肌）和神经细胞等。

不同的微环境分化的组织细胞也不同，其微环境中的各种不同的细胞因子是最主要的决定因素。BMSCs分化为何种细胞也与其所处的微环境密切相关。受创面微环境的影响BMSCs在创面中的表型可转变为成纤维细胞等，补充受损创面的修复细胞的不足，从而加速创面的愈合，提高其愈合质量^［3］。高艳红等^[5]研究表明：在创伤愈合过程中，主要是依据成纤维细胞合成胶原，然后通过其增殖、收缩等一系列活动，使伤口得到修复。有文献显示BMSCs对受损创面的促愈合作用，可能与BMSCs能够释放许多促进创面愈合的生长因子和细胞因子有关^[4]。

对于BMSCs的研究，国外也有不少的报道。Badiavas等^[5]将异体鼠中获得的有绿色荧光蛋白（GFP）标记的BMSCs静脉注射入有创伤的小鼠，结果在小鼠创面皮肤周边观察到GFP标记的细胞分布，表明了异体BMSCs可以移行到创面并分化为特定的皮肤细胞促进创面愈合。

2. BMSCs与糖尿病溃疡

2.1. 基础研究

2.1.1. 复合MSCs的组织工程皮肤：

组织工程（TE）皮肤即应用组织工程学的方法，将种子细胞与适当的支架相结合，在体外构建成具有一定功能的皮肤替代物。在临床应用中，将其移植于创面，在支架材料逐渐降解吸收的过程中，细胞能正常生长、分化并形成有一定功能的皮肤组织^[6]。

在大面积烧伤、创伤、糖尿病顽固性皮肤溃疡及肿瘤切除术后的创面，往往缺损的皮肤组织较多，在大面积深度烧伤创面对皮肤的需求更为迫切，而目前的治疗方法有自体、异体或异种皮移植，而取自体皮会造成新的创面，且对于皮肤缺损面积大的患者自体皮来源有限，异体皮及异种皮可能产生免疫排斥反应，只能暂时覆盖创面，不能从根本上解决创面愈合的问题，近年来有学者提出TE皮肤修复创面，但对于种子细胞的应用不一，比如：表皮细胞体外培养后作为种子细胞、表皮干细胞分离纯化后作为种子细胞，但由于受到培养周期长、难以准确分离纯化表皮干细胞等的限制，在实际应用中还是存在一定的困难。刘德伍等^[7]通过实验表明MSCs复合胶原构建的TE皮肤替代物移植后可加速新生血管形成、促进创面修复，可用于皮肤缺损的修复治疗。与传统的治疗方法相比，使用TE皮肤有减少对供体组织的需求、对大面积急性创面实现快速覆盖、可作为传递外界生长因子的载体等优点。

张兆清等^[8]研究复合BMSCs的TE皮肤修复皮肤缺损时，以牛胶原为支架，自体BMSs为种子细胞，组建TE皮肤来治疗慢性难愈性溃疡创面，发现创面愈合速度提高了，从而获得了理想的愈合效果。

刘鹏等^[2]以标记了PKH26的MSCs作为种子细胞，构建TE皮肤，来修复皮肤缺损，通过HE染色和免疫组织化学染色来观察创面愈合效果，通过荧光检测追踪细胞的转归。结果显示：创面愈合时间加快，6周后仍可检测到红色标记的BMSCs，免疫组织化学染色显示角蛋白和Ⅰ型胶原表达阳性，表明：创面移植含有MSCs的组织工程皮肤后可促进其愈合，MSCs在皮肤创伤愈合中起了重要的作用，可以作为组织工程领域中的理想种子细胞。

2.1.2. BMSCs与创面愈合：

BMSCs体外条件下可以分化为内皮细胞，体内试验证实其可以形成毛细血管样结构；创面局部应用BMSCs后，其可转分化为表皮细胞，从而促进创面愈合；GFP标记的BMSCs移植到创面皮肤后可以分化为皮肤组织^[9-12]。

Ludwik等^[13]认为：胚胎和成人的干细胞可以长期自我更新，而且可以分化为各种类型的组织，其来源丰富，比如：骨髓、脐带血、外周血、脂肪组织、皮肤和毛囊，已经有应用分离的干细胞加速急、慢性创面愈合的报道。他们提出应用基因与干细胞结合的方法治疗各种急、慢性创面是有效的方法。Ichioka等^[14]在大鼠微循环模型中研究了BMSCs分化的胶原对创面愈合的作用，显示了创面血管生成显著增多。

2.1.3. BMSCs的作用机制：

张兆清认为^［8］：1、MSCs可分化成为成纤维细胞和内皮祖细胞，成纤维细胞是皮肤重建的重要细胞，而内皮细胞在组织重建中可形成血管，且在伤后1 周内参与组织重建；2、MSCs分泌可多种细胞因子和生长因子，其对创伤愈合起着关键作用，这些因子通过不同的机制在局部的炎症反应、上皮再生成、肉芽组织形成、新生血管形成、细胞外基质的分泌中起着重要作用。有学者认为：BMSCs促进大鼠皮肤创面愈合的机制可能与其引起各种生长因子的合成和分泌有关^［15］；hMSCs 通过与表皮细胞接触，可以促进其分裂、增殖和迁移，从而加快创面愈合^［16］；BMSCs可以促进肉芽组织生长和胶原合成，加快创面愈合；BMSCs具有免疫调节功能，BMSCs可产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。蔡黔等^[17]研究表明：同种异体BMSCs在治疗糖尿病足溃疡创面时，在治疗前期（1-4天）能显著提高局部血管内皮生长因子浓度，缩短创面愈合时间，提高表皮覆盖率，其促进创面愈合的机制可能是上调了血管内皮生长因子在全身尤其是局部的表达。

Fathke等^[18]研究表明：在标记的小鼠模型中，远处的BMSCs促进表皮成纤维细胞的重建，尤其是在皮肤损伤的创面中。Han等^[19]研究表明：相对于创面局部成纤维细胞，BMSCs更多的增多了局部胶原、成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子，证实了应用BMSCs治疗创面的前景。

2.1.4. BMSCs的应用途径及计量：

目前关于MSCs的研究中，其应用途径有：TE皮肤、静脉注射和局部应用，在创面研究中主要有TE皮肤及局部应用，但剂量无明确的规定。Lou等^[20]在应用人的脐带血MSCs治疗大鼠的皮肤损伤创面加速创面愈合的研究中，局部外敷MSCs密度为2.5×10⁶/mL，剂量为100ul/cm²。呼和塔娜等^[21]研究BMSCs对豚鼠深Ⅱ度创面愈合的研究中，创面局部外敷密度2×10⁶/mL和2×10⁷/mL的BMSCs，两组治疗速度及局部组织微血管密度无显著性差异。钟晓红等^[4]在研究BMSCs在糖尿病创面向表皮分化的实验中，在糖尿病大鼠创面周边局部注射密度为1×10⁹/L的BMSCs，证实了糖尿病创面中应用BMSCs可分化为皮肤附属器。

对于BMSCs的最佳应用途径及最适剂量尚没有明确的研究，这也许会成为以后研究的方向，但其加速创面愈合的作用是明确的。

2.1.5. BMSCs的安全性：

BMSCs的低免疫原性及定向分化等特征，为其临床应用提供了可能性，目前研究尚无不良效应出现，但其安全性仍需考虑，尤其是在临床中的应用。

董学君等^[22]在研究BMSCs多向分化潜能时提出：BMSCs体外分化培养时，在一定的细胞因子、药物等的作用下，或者在损伤组织的微环境作用下能使BMSCs在形态和功能上向成体细胞分化。但BMSCs的定向分化过程复杂，信号调节通路较多，局部细胞因子在BMSCs分化的不同时期，调控其定向分化的程度和方向。

程峰等^[23]在体外诱导BMSCs向神经分化及凋亡的研究中，证实了表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的诱导培养基可以诱导大鼠BMSCs向神经细胞分化，MSCs诱导分化的神经细胞在3-5天时活力最强，凋亡较少，随着诱导时间的推移，分化细胞状态下降，凋亡比例增多。

2.1.6.同种BMSCs与异种BMSCs的异同点：

由于BMSCs的低免疫原性，同种异体应用BMSCs无排斥性或免疫反应较弱，目前研究中以同种异体BMSCs的应用较多，也有异种BMSCs的应用，但较少。异种BMSCs的应用在骨、肝、神经、心肌方面的研究已由报道。刘傥等^[24]研究表明：兔BMSCs复合带部分松质骨的小牛皮质骨支架材料植入新西兰兔体内具有较好的血管生成能力。杨俐敏等^[25]在应用异种去细胞神经材料和异体BMSCs修复神经缺损的实验中，表明：使用去细胞神经材料作为异种移植材料，未发现有明显的免疫排斥，早期就有血管化迹象，与自体神经移植类似；使用同种异体BMSCs作为种子细胞复合构建的组织工程化神经材料，没有证据显示宿主出现免疫抑制或免疫排斥现象，宿主免疫应答状态与自体神经移植或自体干细胞作为种子细胞的移植材料时的免疫应答状态无明显差异。

2.2. 临床研究

对于糖尿病溃疡创面的治疗大致可分为手术治疗和非手术治疗。大多认为在控制和纠正病因基础上手术是一种行之有效的治疗手段，但由于大多数糖尿病慢性皮肤溃疡患者本身同时合并有其他器质性病变，对手术的耐受性降低，手术风险大大增加，手术治疗受到了很大限制。非手术治疗如中医药治疗、物理治疗、细胞因子治疗、皮肤组织工程使用等疗效不一^[26]。对于糖尿病溃疡的治疗仍需要进一步的探讨。

2.2.1 糖尿病的治疗进展

Yusof等^[27]研究表明：糖尿病足患者皮肤的平均血管数、内皮细胞数级内皮细胞层数均高于非糖尿病足患者，这可能导致其产生溃疡。国内有报道：由于糖尿病患者神经障碍、局部缺血和感染等因素的作用，糖尿病足部溃疡截肢率高达38.1%-75.0%，早期游离皮瓣修复创面可控制创面感染，降低截肢率，提高生活质量^[28]。

在非手术治疗中，曾有研究证实糖尿病溃疡创面应用重组人表皮生长因子凝胶较水剂更能促进其预后，缩短其愈合时间^[29]。近年来有研究证实了BMSCs可以促进糖尿病溃疡创面的愈合，且具有向皮肤附属器及表皮分化的潜力^[4]。

2.2.2 糖尿病研究现状

陆树良等^［30］研究表明：糖尿病大鼠局部糖含量增加与创面愈合延迟存在着不可分割的联系。另有实验证实：高血糖所继发的AGE蓄积可能是糖尿病创面难愈的一个重要原因^［31］。

糖尿病溃疡创面与自身的代谢变化存在着一定的关联，但糖尿病皮肤环境生化改变的重要特征为局部高血糖和晚期AGE的蓄积。在这种状态下，创面的正常愈合过程受到了破坏，创面局部的一些修复细胞过早凋亡，某些细胞因子的表达虽未降低，但部分组织修复细胞却呈现出对生长因子的低反应性。

陆树良等^[32]认为：在糖尿病皮肤中，发挥正常功能活性的细胞因子较少，这可能为在高糖环境下，生长因子蛋白质发生了糖基化改变。在其试验中得出，糖尿病创面愈合的过程中，不仅生长因子的量发生了变化，且FGF2与糖基化蛋白共表达的结果表明，在此过程中，可能存在生长因子被糖基化，其正常功能及活性受到影响。

在创面愈合过程中成纤维细胞的增殖、分化、迁移，加速了创面愈合，而在糖尿病溃疡创面中则受到了影响，FGF2也会由于AGE的蓄积部分失活，这严重影响了糖尿病溃疡创面的生长。

基于以上研究，那么BMSCs应用与糖尿病溃疡创面后是否能转化为有活性的Fb而促进创面愈合？如何影响Fb数目及活性的变化？这是我们研究的一个方向。

3. 问题与展望

虽然目前对BMSCs与糖尿病溃疡创面愈合关系的研究有不少报道，但也还存在不少的问题。如：①BMSCs在动物糖尿病溃疡模型中可以促其愈合，但具体机制尚未阐明；②BMSCs在动物模型中应用较多，结论相对统一和明确。在实际临床应用中，其疗效却很不明显；③BMSCs的质量标准尚未达成共识；④BMSCs在临床中的应用途径及剂量没有确定；⑤BMSCs的来源问题尚未得到真正解决，大多数是科研机构自产自销；⑥异体BMSCs的免疫排斥问题、传染性疾病问题及伦理学问题也未得到明确结论；⑥多中心RCT临床研究仍是空白。

然而，在困难面前，我们更要积极应对，首先要探索BMSCs在糖尿病溃疡创面愈合中的机制。同时对于BMSCs的质量、应用途径及剂量制定出统一的规范化标准。其次，在基础研究取得明确结论的基础上，应进行规范化、科学化的多中心RCT临床研究，使基础与临床有机结合，把基础成果转化为临床实践，以期达到服务于临床、造福于人类的目的。

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作者简介：郑淑娟，女，汉族，山西省翼城县，住院医师，在读硕士，师从于贾赤宇教授，、研究方向创面愈合。

通讯作者：贾赤宇，男，汉族，山西省长治市，北京市解放军第309医院整形美容烧伤修复中心主任 教授 主任医师，研究方向：创面愈合。