连载二 衰老的细胞分子生物学标志和衰老学说

1.3衰老的细胞分子生物学标志

衰老的特征是生理完整性的逐渐丧失，导致功能受损，增加了老年人死亡易损性。这一系列病理改变是人类年龄相关疾病的主要危险因素，包括癌症、心血管疾病、神经退行性疾病和糖尿病等。近年来，衰老的研究不断取得重要进展，尤其是在发现衰老的速度在一定程度上是可受到遗传途径和在进化过程中保守的内在过程的调控[25,26]。如能找到反映这些衰老过程的、相应的细胞分子生物学标志，就有可能在早期干预，以达到预防、延缓、缓解甚至逆转与年龄相关性疾病。进一步改进对衰老过程的理解，以及深入剖析衰老标志与衰老过程间的关系，可能会产生新的风险或预后的生物标志物，以新的治疗靶点和跨领域的转化途径[20]。

一组作者系统分析了文献中的相关研究，试图以如下的标准识别和分类衰老的细胞和分子标志。这些标准是：①每一个标志都应该在正常衰老过程中表达出来;②其实验性加剧，加速衰老;③其实验改善，延长健康寿命。作者提出9个候选标志均在不同程度所满足这一组理想的必要条件，它们通常促进衰老过程，共同决定了衰老表型[25]。这些标志是基因组不稳定性、端粒磨损、表遗传学改变、蛋白质内稳态丧失、营养感知失调、线粒体功能障碍、细胞衰老、干细胞衰竭和细胞间通讯的改变[25]。近年来这9种衰老标志提议，得到不少作者的肯定[19,20,26]。

反映衰老过程的特征是有9个标志，是衰老过程在分子、细胞、组织和机体水平所产生的后果[19]。根据标志与衰老的关系，以及衰老标志之间的功能联系，有作者提出的衰老的9个标志可分为三类：①基因组不稳定、端粒磨损、表遗传改变和蛋白质内稳态的丧失，这些初始标志是造成细胞损伤的原发原因；②紧随其后的是对这些损伤的补偿或拮抗反应，这些反应最初减轻了损害；但如果长期或恶化，最终它们就会变成有害于自己；③失控的营养感知、改变的线粒体功能和细胞衰老是综合标志，是前两组标志整合作用的最终结果，导致与衰老相关的功能衰退[25]。

衰老是由高度保守的细胞内在过程驱动的，目前已定义了一组衰老标志[25]。近有一组作者调查了从酵母到人类真核生物的、有关基础基因表达的年龄相关变化的研究报告，确定了细胞衰老的6个基因表达标志:编码线粒体蛋白的基因的下调;蛋白质合成机制的下调;免疫系统基因的失调;降低生长因子信号;应激和DNA损伤的组成型反应;基因表达和mRNA处理的失调。这些研究包括了衰老和炎症的增加、降低的电子传递链和核糖体合成的减少等广泛报道的衰老特征，同时也揭示了人们对已知的与年龄有关的细胞压力的基因表达反应的缺乏等[26]。

1.3衰老的学说

生物衰老是一种十分复杂的生命现象，衰老的过程是由遗传、表遗传、内外环境和随机因素等共同决定的。试图从其中某一方面来说明衰老的机制都是难以成功的[28-30]。在历史上为了发展一种延长寿命的方法，人类已经创造了三百多种衰老理论;它们每一个都提供了老化的原始原因。然而到目前为止，他们都毫无结果，绝大多数理论都湮灭在历史长河中。目前有几种不同的理论仍在应用，它们都是基于一些可靠、可验证的证据[29,31]；另一方面，近年来衰老分子机制的研究又取得了不少新的进展，将在下文中分别简要介绍。

1.3.1衰老的进化与程序化衰老学说衰老是年龄相关性的、生物功能的下降，最终导致机体死亡的生物特性。这种明显对个体生存不利性状--衰老过程的进化，一直是个生物学之谜。60多年前，Medawar意识到，自然选择的力量随着年龄增长而下降，而这种压力是长久维持生理机能所必需的,故认为衰老是由于选择压力的下降的结果[31]。进一步有作者解释了自然选择压力随着年龄的变化。当生物生长发育至生殖成熟阶段，随着生育能力的下降，细胞和组织功能受到了的选择压力减小，因为有机体存活不再成为是进化的优先项。修复机制变得不那么高效，由此产生的组织和基因组损伤的随机积累，被认为是衰老过程的基础。看来，生物的衰老和死亡程序是适应性的，这些程序提供了一种机制，在生态系统施加的限制条件下调节物种的密度[32]。

在野生环境中，许多物种的平均寿命通常比在受保护的环境中要短。在这种情况下，因为大多数动物在年老之前就死亡了，所以没有选择在年老时有利于或对抗衰老的等位基因。在这个年龄段具有负效应等位基因会在后代中积累，特别是那些在年轻时还有积极的影响的等位基因，就被选择保留下来。所以有人认为，这一理论对衰老过程的存在提供了较为合理的解释，当然仍有需要完善之处[33]。

近年来有作者提出，衰老的过程在遗传上是被编程的，根据这一程序化衰老学说（Programmed aging theories），生物衰老是遗传上的程序化过程，其决定因素和推动力是基因组；控制生长发育和衰老的基因，在发育或细胞周期的特定阶段有序地表达。在人类最典型的例子是婴幼儿早衰综合症（Hutchinson-Gilford progeria syndrome），患儿携带核膜蛋白突变基因，为常染色体隠性遗传病，很早就出现衰老症状12-18岁间过早夭折；其他还发现了一些与衰老和长寿的相关基因[29,34].

然而直到最近，许多作者不接受程序化的衰老理论，根据这一理论衰老是由有目的的、程序化的一系列事件组成，进化的生物学机制内在限定了哺乳动物的寿命，以获得进化优势；并且认为，存在通过操纵单个基因或途径来改变寿命的可行性。反对者认为，该学说在理论上是不可能的，因为它直接与普遍接受的、达尔文的适者生存的进化观点相冲突；另一方面，在实践上现代医学研究是基于衰老不是程序化的观点[35-37]。

1.3.2衰老的自由基学说20世纪50年代Harman提出了衰老的自由基理论，主要基于观察到的衰老速度和衰老表型与活性氧(Reactive oxygen specie ROS)产生和氧化损伤之间的联系。由于大部分ROS来自线粒体，故有人将此理论又称之为线粒体自由基学说[38,39]。随之,该理论得到广泛的响应和研究，日后成为最流行的关于衰老理论之一。根据该理论，在大多数活组织中游离自由基不断生成的活性氧，它们是非常活泼的化学分子，氧化应激通过诱发细胞内大分子DNA、蛋白质和脂类等结构和功能的改变，随着这些损伤在细胞中累积起来，最终导致其功能障碍和缺失，衰老发生，并成为其相关疾病和寿命长短的主要决定因素。虽然生物体内存在先天防御机制如自由基清除、解毒和损伤修复等，以限制这此有害生物学效应的发生；但它们中和连续和大量活性氧产生的能力，随着年龄的增长而变得越来越低效，这样就产生了体内促氧化作用和抗氧化作用之间的不平衡，这就出现了上述的氧化应激现象。

衰老的自由基学说经过数十年的广泛而深入的研究，积累的新证据在整体上无法支持这一学说[41,46]，归纳起来主要有如下几个方面：①活性氧在物学中具有双重作用[47]。活性氧不仅有氧代谢的有毒副产品,会引起细胞损伤，而且还能作为调节基因表达的、内源性氧化还原敏感转录因子的生理调节因子,它们是许多重要信号反应所必需的。最近的研究表明，ROS对于包括细胞增殖和分化在内的几种基本生物学过程的进展是必要的;②关于细胞死亡——先前被认为是ROS通过应激氧化直接杀死细胞的结果；而现在被认为是ROS触发细胞死亡的生理信号或程序化途径的结果。③自由基老化理论不能完全解释老化过程[41,48],最近的发现，特别是在秀丽隐杆线虫和啮齿动物中，表明ROS的产生不是衰老的主要或最初原因[49]。

衰老的自由基理论有一个核心预测是，如果这一理论是正确的，改善或减缓这一过程的损伤的能力,应该与衰老速度的减慢和寿命的延长有关,但回顾来自天然长或短寿动物物种的比较、热量限制动物，和转基因动物实验证据，都不能不能支持这一理论；另在实验控制得很好的情况下，将活性氧作为实验变量分离出来，并没有显示出它的生产或中和与老化或寿命之间的关系[46]。另外，在小鼠抗氧化剂实验研究未发现对寿命有明显影响；临床抗氧化补充剂的试验中，在很大程度上同样令人失望[43]。已有作者认为，越来越清楚衰老是多因素综合作用的结果,拮抗其中一种或数种因素很难产生显著的影响，看来自由基、活性氧在老化过程中可能不起重要作用，因此生物的寿命并不能显有著延长[50]。

1.3.3衰老的端粒学说

端粒(Telomeres)是在染色体两个末端、形成的保护性结构，是由DNA重复序列与核蛋白组成。端粒可以保护染色体的末端不受破坏，以及可能的、与相邻染色体末端融合，在维护基因组稳定性方面起着关键作用。在脊椎动物端粒中的重复核苷酸序列是TTAGGG，互补DNA链是AATCCC，重复序列的尾部带有一段单链TTAGGG。TTAGGG序列在人类重复了大约2500次，平均端粒长度从出生时的约11kb，老年时的下降到低于5kb，男性的平均下降率大于女性[29,51-56]。

在有丝分裂过程中，复制DNA的聚合酶在DNA模板链连续合成，并向5’端延伸，完整复制；而在后随链不能连续合成，形成冈崎片段，而它们的合成需要RNA引物附着在后随链上，合成结束后RNA被消除，就形成端粒末端单链DNA尾。下次复制时DNA就缩短一段，随着细胞分裂连续进行，染色体末端不断被缩短。这样看来，端粒犹如一个缓冲区，避免了持续的细胞分裂引起的序列缩短，进而损伤基因[29,57,58]。

在20世纪60年代，Hayflickt等应用人工合成的TTAGGG探针，测定不同年龄人群成纤维细胞的端粒长度，结果发现端粒的长度随年龄增长而下降；在培养人的成纤维细胞的端粒，也随细胞分裂次数增加而下降，当缩短到一定程度后，细胞就发生不可逆的增殖停滞，所谓细胞衰老（Cellular senescence）现象出现，端粒缩短是人类成纤维细胞复制衰老的关键机制。进一步积累的资料表明，端粒的长度和完整性可以防止端粒功能障碍，被认为是高等哺乳动物衰老和长寿的主要决定因素之一[29,52,59]。

随年龄增长，人类在多数类型的组织细胞显示不可逆的端粒缩短，端粒缩短与衰老相关疾病(包括癌症、糖尿病和认知障碍)之间存在强相关。还有几种表现出人类早衰特征的、单基因遗传性疾病与端粒缩短有关，统称为端粒疾病。这些疾病有重叠的症状，以及一种内在共同的端粒功能障碍的机制；但也表现出不同的症状和发病年龄，表明它们属于一系列的疾病。端粒疾病是由端粒维护机制的缺陷引起的，而次级端粒疾病与初级端粒疾病有一些重叠的症状，但通常是由于参与维持的DNA修复蛋白的突变所致[55,57]。

端粒长度调控的多因素本质，增加了该领域研究的复杂性。端粒长度的特点是个体和物种之间的高变异性，但与寿命长短的关系尚待进一步研究。端粒长度的特征也是高度可遗传的，女性比男性更长寿。另有一些研究表明，端粒长度与预期寿命、饮食、体育活动、肥胖、应激，以及与DNA损伤、衰老相关疾病的发生有直接关系[51,52]。新出现的资料表明，端粒长度能被遗传学和表遗传学因素、性激素、活性氧和炎症反应等因素所修饰[53]。一个人出生时最初的端粒长度很大程度上取决于环境因素；随着细胞分裂，个体暴露于污染空气或生存于低的住宅绿地都与较短的端粒相关[60]。

端粒长度表示在细胞分裂过程中，不完全DNA复制缩短端粒的过程与端粒酶延长端粒的过程之间相互作用的最终结果[53]。缩短端粒的长度反映了细胞的有丝分裂历史、炎症和氧化累积暴露以及端粒酶的可用性。极短的端粒会导致细胞衰老、凋亡或基因组不稳定，而较短的端粒则与较差的健康状况和预测死亡率相关[[61]。但也有作者认为，端粒长度可以预测死亡率，端粒随着年龄的增长而缩短，这些关联并不能代表因果关系；端粒酶敲除和过表达的研究发现，端粒导致衰老的证据很少。因此，从现有的知识认为端粒是引发衰老的原因，还仅是一种推测[62]。

1.3.4衰老的表遗传学说

表遗传学是研究没有DNA序列变化的、可遗传的表达改变;表遗传学机制是可遗传、又可逆的生化过程。表观遗传学还提供了环境、基因组和疾病表型之间的联系。表遗传调控的三个主要分子机制是DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA。这些表遗传机制的改变，能影响绝大多数核内生物学过程，包括基因转录和沉默、DNA复制和修复、细胞周期演进、端粒和着丝粒结构和功能。它们对生长发育和衰老死亡具有重要的作用。饮食和其他环境可以通过改变表遗传信息，来影响我们的寿命;表遗传酶抑制剂可以影响模型生物的寿命。考虑到表遗传信息的可逆转的本质，这些研究为治疗衰老及其包括在内的相关疾病(包括)提供了新的前景[63-66]。衰老是一个多层次的过程，最初的研究多关注衰老的遗传因素，结果发现随着年龄的增长，因DNA损伤修复能力的逐渐下降，端粒损耗和突变积累成为基因组不稳定的主要原因。近十多年来，在模型生物和人类的研究表明，表遗传变化对衰老过程有着巨大的影响。这些表遗传变化发生在不同的水平，包括核心性组蛋白的体积下降、组蛋白翻译后修饰、组蛋白变体替换、DNA甲基化模式改变，以及非编码RNA的异常表达等，其结果改变了局部对遗传物质的可及性，导致异常基因表达和基因组不稳定性的增加，从而促成或加速衰老[66,67]。

DNA甲基化是最重要的表遗传修饰之一，在基因表达调控、基因组印记、X染色体失活、肿瘤发生等方面发挥着关键或重要作用。DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases DNMTs)是介导DNA甲基化过程的关键酶，通过它们甲基化模式被忠实地复制或重新产生，并成为表基因组DNA组成的一部分。DNA甲基转移酶高度保守，具有类似的氨基酸序列。N-端包含一个调控域，允许DNMTs固定在细胞核内，识别核酸或核蛋白；而c端具有催化域，负责酶的活性[64,68]。

1967年了首先在鱼类描述了DNA甲基化与衰老的关系，发现基因组的总DNA甲基化随着年龄的增长而减少。随后在不同的小鼠、大鼠和人类组织中，也证明存在甲基化逐渐丢失的现象[69]。近十年来应用下一代测序技术和微阵列等先进方法深入进行研究。在新生儿、中年人和百岁老人基因组甲基化含量比较研究中发现，与新生儿较均质的甲基化DNA相比，百岁老人的DNA甲基化含量较低，而中年人DNA甲基化含量位于新生儿与百岁老人甲基化含量之间[70]。以妇女血液细胞中的重复序列Alu甲基化程度为指标，评价衰老与其变化的关系，结果发现，血液细胞中的Alu去甲基化从大约40岁开始，Alu低甲基化程度随年龄增长而增加。骨量随着年龄的增长而减少。统计分析表明，Alu低甲基化与高龄和低骨密度相关(P<0.05)[71]。随着资料的积累，近有评论了衰老的基因组低甲基化假说认为，随着年龄的增长，发生全基因组DNA甲基化的总体下降，并认为全基因组DNA甲基化的下降，可能是衰老的一个重要因素，导致基因表达调控能力下降和基因表达的异常[72]。

衰老引发的基因组甲基化模式的改变，除上述的总DNA低甲基化外，还可引发特殊位点或DNA序列的高甲基化。一般说来，年龄相关的高甲基化被认为优先影响CpG岛的位点，而缺乏CpG岛的位点随着年龄的增长而失去甲基化[69]。人类表皮是一个研究年龄相关的表遗传变化的良好模型，应用阵列法生成并分析了目前最大的人类表皮甲基化组，结果发现，与年龄有关的DNA甲基化模式的异常改变，其特征是动态范围减少，整体甲基化模式的异质性增加。甲基化模式的这些变化伴随着降低的转录网络连接，使表遗传调控保真度的降低或丧失，并定义为衰老表观基因组的一个关键特征[73]。

深入研究发现，衰老相关的、不同基因组甲基化模式，常具有特定的染色质背景特征。例如，在分化细胞和间充质干细胞(MSCs)的衰老与DNA高甲基化相关，该区段富集抑制性组蛋白翻译后修饰；而它们的低甲基化的CpG位点强富集在活跃的染色质标记H3K4me1中，这表明这是在衰老过程中一个与细胞类型无关的、DNA低甲基化的染色质特征[74]。癌症是一种与衰老相关的疾病。在衰老和癌症中变得高甲基化的基因启动子在ES细胞中有一个共同的染色质特征。低甲基化的DNA序列发生在非常不同的染色质背景中。在衰老过程中，DNA低甲基化富含在以激活组蛋白翻译后修饰H3K4me1为标记的基因组区域中；而在癌症中，DNA甲基化的丧失主要与抑制性的H3K9me3标记有关[75]。

1.4细胞分子生物学机制

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