前沿:脊髓损伤的细胞治疗

脊髓损伤(SCIs)造成全世界数百万个人和家庭的巨大身体、社会和经济损失。以细胞为基础的治疗是脊髓损伤的一种令人兴奋的神经保护和神经再生策略。本文总结了迄今为止最有前途的临床前和临床细胞疗法，包括间充质干细胞、神经干细胞、少突胶质细胞祖细胞、雪旺细胞和嗅鞘细胞移植，以及激活内源性多能细胞的策略。在整个过程中，强调以细胞为基础治疗的基本生物学，脊髓损伤病理生理学的关键特征，以及每种方法的优点和局限性。还强调了全球已完成和正在进行的临床试验及其结果的双向转化。然后，本文概述了关键的辅助策略，如营养因子支持以优化移植物的存活和分化，生物工程材料提供支持支架，电场刺激迁移，以及降解胶质瘢痕的新方法。本文还讨论了启动细胞治疗临床试验时需要重点考虑的因素，如临床级细胞系的扩增、细胞存储和运输，以及移植方案。最后，本文展望了脊髓损伤细胞治疗的未来以及该领域跨学科合作的机遇。

1 流行病学

脊髓损伤的流行病学是设计临床试验时要考虑的重要因素。创伤性脊髓损伤男性(79.8%)多于女性(20.2%)。大多数损伤是颈椎(约60%)，其次是胸(32%)和腰骶(9%)。年龄分布呈双峰分布，一个高峰出现在15岁至29岁之间，第二个高峰出现在50岁以后，这个高峰较小但在不断增长。高能量机动车碰撞(MVCs)和运动相关伤害主要影响年轻人。低能量创伤，如跌倒，在60岁以上的老年人中更常见，因为他们更容易发生退行性脊髓病。有趣的是，在北美的SCIs中，MVCs占比在减少 (38%)，而摔倒占比在增加（31%），其次是运动相关的损伤占10%到17%。

2 病理生理学

2.1急性损伤及伤后微环境

最初的创伤事件引起细胞膜通透性增加，离子和小分子失调，敏感的微血管供应损伤导致缺血。这些事件一起引发继发性损伤级联，并产生进一步的永久性损伤。几个小时后，进行性水肿和出血周期性地加重了的损伤后微环境。受损的血脊髓屏障(BSCB)使脆弱的脊髓暴露于炎症细胞、血管活性肽和细胞因子，如肿瘤坏死因子和白细胞介素-1β。持续的细胞死亡释放DNA、ATP和K⁺到微环境中;小胶质细胞通过分泌额外的促炎细胞因子和促进大量巨噬细胞、中性粒细胞和附近的小胶质细胞的浸润作出反应。进而激活星形胶质细胞和内皮细胞，进而分泌BMPs、TGF-β和Notch活化配体Jagged等因子。激活的吞噬细胞可以清除损伤内的髓鞘碎片，但也产生氧自由基(如O^2-、过氧亚硝酸盐和过氧化氢)和细胞毒性副产品，通过脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤造成额外的细胞死亡。当神经元死亡时，细胞外谷氨酸积累，星形胶质细胞的再摄取能力丧失。通过NMDA、红藻酸盐和AMPA受体过度激活，结合ATP依赖的离子泵功能障碍和随后的钠失调，导致剩余神经元的兴奋性毒性死亡。在全身水平上，呼吸功能差可导致缺氧，而失去对血管的交感神经支配可导致严重的低血压。再加上脊髓自身调节能力受损，可能导致损伤后持续缺血数天至数周。在这种级联损伤中，急性和亚急性细胞死亡的多种病因是基于细胞的神经保护疗法的重要靶点。

2.2 阻碍恢复的因素

在中间及慢性阶段，急性炎症消退，脊髓经历ECM成分的改变，试图再髓鞘形成和神经网络的重塑。虽然这可能导致有限的恢复，但多个障碍局部环路和长传导束再生的因素持续存在。早期神经胶质细胞的死亡和变性破坏了脊髓的结构框架，导致微囊空泡的形成，其中包含细胞外液和薄结缔组织带。这些空腔合并成更大的集合，缺乏定向轴突再生和再生细胞迁移的基质。此外，少突细胞易发生坏死和凋亡。它们留下的剥脱的轴突不能进行快速的跳跃传导，特别容易发生非功能性电活动，这进一步导致了不良的恢复。损伤后早期，星形胶质细胞也在病灶周围区增殖，并紧密交织成不规则网状的突起，以隔离损伤区域。中央管周围的神经干细胞和祖细胞也可分化为星形胶质细胞，从而导致星形胶质细胞增生。该区域的星形胶质细胞、周细胞和室管膜细胞生成密集的硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)、NG2和腱生蛋白沉积，形成胶质瘢痕的纤维成分。虽然有文献支持瘢痕的有益方面，但更多证据表明，慢性瘢痕通过充当物理屏障和紧密结合跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶受体，有效地抑制轴突再生和神经突生长。

此外，中枢神经系统髓鞘和神经元相关配体，如髓鞘相关糖蛋白(MAG)、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(OMgp)、神经突生长抑制因子(NOGO)和信号量蛋白3A/4D，结合NOGO受体-p75复合物(NgR)和丛状蛋白来激活Rho GTPase及其下游效应物Rho相关蛋白激酶(ROCK)。这导致肌动球蛋白收缩性的改变和轴突生长锥的崩溃，并进一步抑制再生。还有其他有效的轴突再生抑制剂，如在损伤脊髓中上调的斥力引导分子A。

下面讨论的多种细胞策略旨在保护和/或再生具有功能和髓鞘的神经回路，以增强功能恢复。

3基于细胞的疗法

以细胞为基础的治疗包括细胞移植和利用内源性神经前体细胞的潜能。细胞治疗可以免疫调节，改变微环境，并根据细胞类型、细胞状态、给药途径(例如，全身还是局部)和给药时间来替换损伤的细胞。最常被研究和最有希望的细胞类型包括间充质干细胞(MSCs)、神经干细胞(NSCs)、少突胶质细胞祖细胞(OPCs)、雪旺细胞(SCs)和嗅鞘细胞(OECs)。表1列出了关键的临床前研究，表2和表3分别总结了已完成和正在进行的临床试验。

3.1 细胞来源

MSCs、SCs和OECs都可以从成年异体源中获得，增殖成功进而标准化。MSCs、SCs和OECs也可以直接从患者体内提取，以避免移植后免疫抑制。然而，自体原代细胞通常成本较高，需要在移植前进行手术获取、体外扩增和鉴定。CNS细胞，如NSCs、OPCs、星形胶质细胞和小胶质细胞，从成人同种异体供体中分离更具有挑战性，而且一个系的表现受供体年龄、遗传和获取条件的影响。此外，自体中枢神经系统组织难以获取。因此，这些细胞通常来自胚胎干细胞(ESCs)来源。ESCs可以无限繁殖，可以产生任何胚层的细胞。然而，干细胞来源的移植物的使用存在伦理问题，可能会出现核型不稳定或由于不完全或异常分化而具有肿瘤发生的可能。最近，诱导多能干细胞(iPSCs)允许从自体、可获取的细胞(如骨髓和皮肤成纤维细胞)中衍生NSCs和OPCs。这一策略已被进一步调整，可以直接重编程成人体细胞到多能神经胶质细胞，而绕过多能状态。在最近的研究中，可以将容易获得的体细胞直接转化为神经元、神经元亚型和少突胶质细胞祖细胞。与这些策略相关的一些限制，如重编程效率、谱系变异、谱系特异性分化和表观遗传记忆保留正在研究中。

3.2 神经干细胞

NSCs是一种多能的可以自我更新细胞，具有替代损伤后丢失的神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞的潜能，引起了人们的极大兴趣。在胚胎发育过程中，神经干细胞遍布整个神经管，根据它们的位置和对模式形态形成因子的暴露时间获得独特的标签。在成人中，它们分布在数量较少的区域，如大脑的脑室下区和脊髓的中央管周围。有两种不同的NSC群体可以从成人脊髓中分离出来:(a)原始NSCs (pNSCs)和(b)由pNSCs产生的普通NSCs (dNSCs)(图2)。pNSCs是表达多能性标记物Oct4的罕见细胞，体外对白血病抑制因子有反应。成人中dNSCs更为丰富，表达星形胶质细胞标记物GFAP，体外对表皮和成纤维细胞生长因子(EGF和FGF)有反应。这两种细胞都能增殖和产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

大量的大、小动物临床前研究为ESCs来源NSCs或同种异体成人来源的NSCs移植的治疗效果提供了证据。最近，自体iPSC来源和直接重编程的NSCs越来越受重视，可以减轻免疫排斥反应的担忧，并在数周内产生高度纯净的细胞群。2016年的一项荟萃分析(N = 74项研究)发现，所有来源的NSCs都能在脊髓损伤模型中提供显著的运动恢复(SMD = 1.45; 95%置信区间[CI]: 1.23-1.67; P＜0.001)。尽管在临床前研究中仍在继续研究其恢复机制，但可能与营养因子(如BDNF、GDNF、IGF-1等)、轴突的再髓鞘化、神经回路的部分再生和重塑以及ECM沉积有关。最近的研究表明，将移植的脊髓NSCs自组装成器官型的、类似背角的结构域，突出了它们的可塑性和进一步优化治疗的潜力。

目前，在中国进行的I/II期研究(N = 30;NCT02688049)在慢性AIS A级C5-T12损伤患者中比较了1×10⁶个MSCs和线性排序的胶原生物材料神经再生支架支持的NSCs。研究预计于2020年结束，并对AIS分级、体感诱发电位、运动诱发电位、功能独立性测量和MRI评估进行报告。Neuralstem也在进行一项试验(N = 8; NCT01772810) NSI-566，即人类胎儿脊髓NSCs，通过6次椎管内注射给1-2年胸髓损伤的患者。2016年，Stem Cells Inc公司领导的两项II期临床试验在完成前就终止了。这些研究是为了评估人中枢神经系统干细胞移植对胸髓(NCT01321333)和颈髓(NCT02153876) SCI的影响。最近发表的一篇研究报告发现，将剂量增加到4.0×10⁶，耐受性良好，与细胞或徒手注射技术相关的严重不良事件没有显著增加。根据新出现的临床前数据，可能进一步修改体外细胞和/或改变局部环境将是必要的，以促进功能恢复。

3.3 少突细胞祖细胞

OPCs是一种多能细胞，主要分化为少突胶质细胞，再髓鞘化轴突。它们适合于脊髓损伤的再生，因为它们对损伤反应迅速，可以自我更新，并解决损伤病理生理学的一个重要组成部分。动物研究表明，移植的OPCs可促进白质保留，增加内源性少突胶质细胞的存活数量，减少空腔体积，增强运动恢复。潜在的机制可能是再髓鞘形成、局部免疫调节、营养因子分泌和提供支持生长轴突的物理支架的组合。这些细胞还具有一个有利的分泌组，由生长因子、神经营养因子、趋化因子和细胞因子组成，并能与神经元形成谷氨酸能突触，这是一个正在研究的领域。目前尚不清楚改善的结果是由于这些因素，还是直接脱髓鞘的轴突再髓鞘化，以及损伤后再髓鞘化本身在多大程度上增强了功能。

Geron公司的一项评估人类ESCs衍生OPCs的大型临床试验因经济原因而中止。Asterias Biotherapeutics公司获得了新的资金支持，延长了这些细胞(AST-OPC1)在I/IIa期开放标签、剂量递增研究中的试验(N = 25; NCT02302157)。2×10⁶、1×10⁷或2×10⁷细胞在C4 ~ C7处AIS A级或B级损伤的脊髓损伤患者21 ~ 42天后移植。这项研究于2019年完成，BioTime后来更名为Lineage Cell Therapeutics，收购了该公司。关键的发现是12个月时，没有显著不良事件的增加以及在MRI上有再生的证据。在接受1×10⁷和2×10⁷剂量治疗12个月后，95%的患者至少改善了1个AIS等级，32%的患者至少改善了2个AIS等级。长期的跟踪正在进行中，公司计划进一步优化细胞的制造过程。

3.4 嗅鞘细胞

嗅鞘细胞是环绕嗅觉神经元的特殊胶质细胞，在中枢神经系统-鼻粘膜过渡过程中清除细菌和碎片。它们还分泌神经营养因子，维持一个有利于神经元功能的环境。当嗅神经或嗅上皮受损时，嗅鞘细胞支持嗅上皮细胞来源的神经元进入嗅球。它们不同于典型的胶质细胞，但与星形胶质细胞和SCs有许多共同的形态学和分子标记。移植后，OECs形成一种细胞基质，损伤的轴突可以通过它在脊髓横断损伤部位再生。嗅鞘细胞可以从鼻粘膜或直接从嗅球移植到脊髓实质，作为一种桥接、非中继的方法。OECs也被证明能增强神经突的生长，促进再髓鞘形成，神经保护，提供细胞生长指引，以及局部免疫调节。

一些临床试验已经为亚急性和慢性脊髓损伤移植了嗅鞘细胞。早期工作证实了OECs纯化种群的安全性; 然而，随后使用粘膜组织的研究报告了相互矛盾的结果。为了澄清这一差异，对关键临床试验(N= 1193)进行meta分析，发现严重不良事件的增加无统计学意义;然而，由于现有研究的技术和方法方面的考虑，其有效性还没有确定。最近，一项小规模的I期试验(N=6)对自体粘膜OECs和嗅觉成纤维细胞的研究表明，AIS A级损伤患者移植后感觉运动得到改善; 然而，需要更大的样本量和更长的随访来证实安全性和有效性。

3.5 雪旺细胞

SCs是外周神经系统(PNS)中的髓鞘细胞，是PNS自发再生的重要组成部分。它们提供了一种结构支架，充当引导生长轴突的导管。它们还通过表达生长因子和细胞外蛋白产生有利的环境。在脊髓损伤动物模型中，它们已被证明能促进组织保留，减少囊性空化，增强中枢神经轴突再生，再髓鞘化轴突，并增强内源性SC髓鞘化，从而导致感觉运动恢复。SCs的促生长特性也被用于联合治疗。例如，神经保护剂D15A(一种修饰的人类NT3，可以激活TrkB和TrkC受体)与磷酸二酯酶-4抑制剂（罗立普兰）和SCs结合，以增强轴突保留和血清素能纤维长入和长出SC移植物。SCs还与NSC、OEC和BM-MSC联合移植，以提高细胞存活率和促进额外的再髓鞘形成。

在临床研究方面，The Miami Project to Cure Paralysis项目进行了一期开放标签研究(N = 8;NCT02354625)对慢性AIS A-C级C5-T12损伤个体的自体SCs移植进行了研究。这项研究于2019年8月完成，结果尚待公布。同一组进行了一项开放标签、非随机、非控制、剂量增加的I期研究(N = 6)，将自体SCs移植到病灶中心，治疗亚急性-中度AIS A级胸椎损伤。在损伤后5 ~ 30天内从腓肠神经中提取SCs，在体外扩增，并在损伤后4 ~ 7周内移植。1年后，没有任何并发症表明治疗的不安全性。

3.6 间充质干细胞

骨髓间充质干细胞是一种多能、自我更新的结缔组织祖细胞，遍布全身，特别是在血管周围区域。它们有能力再生肌肉(肌细胞)、软骨(软骨细胞)、骨(成骨细胞)和脂肪(脂肪细胞)。具备进行临床试验的有利条件。多能性MSCs扩张迅速，在−80℃或液氮冷冻保存后仍能存活，异体移植后表现出最低的免疫反应性，可以从脂肪、骨髓和骨骼肌等可获取的组织中获取。这促进了其在多个领域的转化，如败血症，多发性硬化症和关节炎。在脊髓损伤中，骨髓间充质干细胞已被证明可以促进血管生成，并通过神经营养信号传导和免疫调节显著增强神经组织保留。也有证据表明，直接移植到脊髓的骨髓间充质干细胞可以调节巨噬细胞的激活并促进组织保留。然而，MSCs移植显示了相当大的可变性，一些研究显示了积极的效果，而有些则没有(表1)。

多个脂肪细胞来源的MSCs临床试验正在进行中，以评估安全性、剂量和有效性。梅奥诊所正在进行I期研究(N = 10; NCT03308565) ，AIS A/B/C级损伤患者，移植前有2周至1年病程，接受1×10⁸个自体脂肪来源的间充质干细胞移植。这项研究将于2023年完成。

骨髓来源的间充质干细胞也在研究中。II/III期试验(N = 32; NCT01676441)由Pharmicell Co公司开展的对慢性颈髓AIS B级患者的1.6×10⁷和3.2×10⁷自体骨髓源间充质干细胞移植进行评估，随访12个月的ASIA运动评分、MR扩散张量成像和电生理参数。这项研究预计将于2020年结束。

脐带源MSCs(UC-MSCs)也是MSCs的替代来源。UC-MSCs可以从脐带组织、脐带血或华通氏胶中分离出来，华通氏胶是一种在脐带内隔离血管的胶状物质。脐带组织易于获取且经常被丢弃，来自脐带的MSCs不太容易发生排斥反应，这证明发生移植物抗宿主病的风险较低。与成人来源相比，从脐带血或胎盘组织中获得的间充质干细胞数量较少，尽管它们很容易扩大，组织可以冷冻并用于以后的分离。来自脐带的间充质干细胞也被证明具有免疫调节特性。几个最近注册的I/II期临床试验(NCT03505034;NCT02481440; NCT03521323)正在招募评估用于亚急性和慢性SCI的异体UC来源的MSCs。约旦的一项I/II期开放标签研究(N = 14; NCT02981576)直接比较了AIS A/B/C患者受伤2周或以上时，鞘内移植脂肪与骨髓源性间质干细胞的不良反应和AIS改善。该研究于2019年1月完成，结果尚待公布。

3.7 内源性干细胞治疗

促进神经修复的另一种方法是利用常驻干细胞的潜力，如受损的中枢神经系统中的NSCs。这种方法规避了免疫排斥、细胞给药挑战和管理上的障碍，如GMP等级的扩增、细胞存储和运输。在脊髓内，已证实NSCs对损伤的反应是增殖和迁移到损伤处，尽管这种作用可能不足以恢复。最近，人们发现小分子，如FDA批准的药物环孢素A和二甲双胍，可以增加内源性pNSC和dNSC池的大小，以增强这种内源性损伤反应。环孢素A是一种免疫抑制药物，已被证明可以提高NSCs的存活率并促进其在脑内恢复。在脊髓中也观察到环孢素A激活NSCs，正在进行的研究旨在阐明其在脊髓损伤后的作用。二甲双胍，一种常用的治疗II型糖尿病的药物，也被证明可以激活内源性NSCs并引导其向神经元和少突胶质细胞分化。虽然这些作用的分子机制尚未被阐明，但二甲双胍治疗已被证明可改善脑损伤后的功能恢复。二甲双胍在脊髓损伤动物模型中的研究正在进行中。正在探索的增强内源性NSCs反应的其它靶点是C-Kit和ErbB2信号通路。

4 增强型细胞移植疗法

脊髓损伤动物模型的移植细胞存活率历来较低。这通常是通过提供过量的细胞数量来弥补损失来克服的；然而，这种方法在治疗中引入了可变性，将细胞死亡的细胞毒性副产品带入到微环境中，当需要大量存活的细胞时就变得不可行。目前正在进行的研究旨在通过克服SCI微环境中的关键障碍来提高细胞生存、迁移和轴突生长。

4.1 生长因子

为了支持移植物存活，生长因子(如PDGF、EGF和IGF-1)、神经营养因子(如BDNF、NT3、NGF)和抗炎药物(如二甲胺四环素)均已通过鞘内注射和泵入成功输送。独特的生物材料也被设计来逐渐提供支持移植的关键因素。生长因子和铁蛋白等治疗也与增强内源性OPC增殖和少突细胞发生有关。然而，泵容易故障，需要补充和移植操作，并使生长因子长时间暴露在哺乳动物体温下。因此，仍需研究替代方法，如将细胞与能够缓慢释放生长因子的生物材料一起移植到体内。这种独特的策略将在下面的生物材料一节中进一步讨论。另一种方法是对细胞进行体外遗传修饰或在体内转染内源性细胞来分泌必要的因子。例如，MSCs已被成功设计成在体内表达bFGF、HGF、NT3、BDNF和GDNF等。SCs也同时被转导过表达BDNF和NT3。同样，人类iPSCs、ESCs和NSCs的安全高效的工程方法目前正在开发中。

4.2 康复治疗

康复是一种经常被忽视的非侵入性促进内源性营养因子释放和长期细胞存活的方法。物理康复，无论是否使用电增强术，都是脊髓损伤患者护理计划的一个组成部分; 然而，它在临床前试验中未被充分呈现。无论康复需要进行强迫跑步机训练，自由游泳，或特定任务的测试，如前肢伸展，功能上的好处是显著的。除了增强心肺和肌肉骨骼功能外，跑步机运动训练已经被发现通过增加IGF-1信号通路来提高移植NSC的存活率5倍以上。这一发现强调了多模式、跨学科的SCI护理的价值。

4.3 生物材料

生物材料可以在几个方面增强以细胞为基础的脊髓损伤治疗方法。取自天然或合成聚合物的支架被植入病变腔内，桥接间隙，作为轴突生长和细胞迁移的基质。InVivo Therapeutics公司的神经-脊柱支架是一种多孔的生物可吸收聚合物支架，在临床前脊髓损伤模型中，可促进损伤愈合、白质保留和实质内组织压力正常化。最近的一项病例研究(NCT02138110)随访6个月，报告没有急性支架植入相关的不良反应。支架还可以为种子细胞提供物理基质，为轴突提供定向指导。此外，生物材料还可以作为运载细胞和释放生长因子的载体，帮助移植物细胞生存、整合和分化。可注射的原位聚合水凝胶可以将细胞和因子直接输送到病变部位。例如，透明质酸/甲基纤维素(HAMC)的聚合物混合物是可注射、原位胶凝、可生物降解和无细胞毒性的。PDGF-AA修饰的HAMC可增强共移植大鼠脑源性NSCs的移植物存活率和少突胶质细胞分化，促进受体少突胶质细胞保留和改善精细运动功能。进一步用RGD肽修饰HAMC水凝胶可促进人iPSC衍生OPCs的存活、整合和分化。另一种方法是使用纤维蛋白支架，这种支架已被证明可以促进脊髓损伤后移植干细胞的存活，当与生长因子共同使用时，可以用于指导分化和促进恢复。QL6是一种令人兴奋的多肽生物材料，在生理温度下可自组装形成类似晶格的结构。在脊髓损伤的颈椎模型中，注射NSCs的QL6改善了移植物的存活，减少了胶质瘢痕和炎症，改善了前肢功能。

4.4 趋电性

电场(EFs)是存在于活组织中的物理环境线索。在发育过程中，多能细胞依赖这些场进行适当的迁移和分化。如果电场被破坏，就会产生严重的缺陷。电场刺激也被证明能在成体损伤后引导细胞。治疗性趋电(细胞在电场中的定向迁移)利用外用电场刺激细胞的电敏感性来促进迁移。这在SCs、NSCs和许多其他类型的细胞中都是可行的。内源性和移植的NSCs，而不是它们分化的后代，都被证明在经颅直流电刺激下迁移；然而，定向迁移将需要进一步优化，以建立理想的电流、电压、相位、导线位置和EF应用的时间。

4.5 破坏胶质瘢痕

神经胶质/CSPG瘢痕在慢性损伤中很容易形成，并限制了损伤区/损伤周围区域的轴突再生。一项关于NSCs治疗的荟萃分析发现，在急性期(SMD = 1.80; 95% CI: 1.36-2.24)或亚急性期(SMD = 1.38;95% CI: 1.08- 1.67)比慢性期(SMD = 1.04;95%可信区间:0.47 ~ 1.60;P = .03)细胞移植能更好地促进运动功能恢复，表明慢性损伤脊髓再生困难。因此，许多实验室都专注于在细胞移植期间或之前破坏胶质/CSPG瘢痕的方法。软骨素酶 ABC (ChABC)是一种能在SCI迅速降解长粘多糖(GAG)侧链CSPGs的细菌酶，鞘内或实质内 ChABC治疗已被证明能够促进神经突生长，提高解剖可塑性，通过降解神经元周围CSPGs，促进感觉运动行为复苏。这种方法正在进一步发展，以解决关键的局限性，并更好地与细胞移植结合。首先，ChABC的热稳定变体正在开发中，以在哺乳动物的体温下保持较长时间的活性。第二，ChABC是通过新型载体给药，如亲和力释放生物材料或宿主细胞慢病毒转染。最后，正在研究具有GAG或CSPG核心蛋白降解活性的替代人类酶，以减轻使用细菌蛋白相关的免疫原性风险。

另一个令人兴奋的方法是抑制蛋白酪氨酸磷酸酶σ受体与其CSPG配体的结合。一个例子是细胞内西格玛肽(ISP)，在损伤后皮下注射，通过BSCB，导致损伤脊髓内显著的轴突再生。近年来，ISP也被证明与白细胞抗原相关受体阻滞剂相结合具有间接的免疫调节作用。

5 . 转化干细胞疗法

5.1 移植物存活

将细胞疗法应用于临床的主要挑战是评估和优化移植存活率。与临床试验或临床常规使用相比，实验室中的培养和储存条件、处理方式和移植条件有显著不同。此外，常用的移植评估技术，如免疫组织化学和生物荧光标记，通常不可能用于人体。前面讨论过的策略，如增加营养支持、定时康复和生物材料协同给药，被证明是促进人体细胞治疗的重要佐剂。这些已经在实施中，如InVivo Therapeutics公司的神经脊髓支架(NCT02138110)或使用神经再生支架(NCT02688049)的MSCs和NSCs的I/II期研究。随着基于MR的新型细胞追踪方式的开发，人体活体评估移植细胞也变得可行。

5.2 免疫排斥反应

另一个重要的转化障碍是明晰和克服中枢神经系统内潜在的免疫排斥反应。细胞移植排斥反应在人中枢神经系统内的程度和时间目前尚不清楚。此外，细胞来源(如自体、异体、转基因等)可能会显著影响人体移植后的存活率。增强内源性细胞增殖是避免免疫排斥反应的策略之一；然而，内源性细胞池仍然有限，驱动其分化和迁移的最佳方法尚未建立。最近，修饰主要组织相容性复合体和CD47的遗传技术已被证明可以产生免疫逃避的iPSC系。这可能成为未来保护移植物免受免疫细胞伤害的重要策略。

5.3 GMP级别扩增

要将细胞疗法有效地转化为临床试验，需要仔细规划GMP设施和扩大策略。GMP级生产的许多挑战通常不会在研究环境中遇到，而与巨大的财务成本有关。例如，所有的人工操作必须在设备之间高度重复，并在严格的GMP级洁净室中进行。必须建立标准操作程序，并在整个生产链上追溯合规情况。培养物通常不含动物产品(如蛋白质、饲养细胞等)，除非没有更合适的选择，而且所有试剂都需要符合GMP级培养标准。普通的病毒转导和非病毒转染(如电穿孔、脂质体转染)技术需要额外的步骤来验证病毒颗粒或外源DNA固有的风险已经减轻。此外，必须建立主细胞库和工作细胞库，并在每个制备步骤中对细菌、病毒、真菌、支原体和内毒素进行广泛测试。值得注意的是，在这个转化过程中，临床前疗效得到验证的研究细胞系可能与最终的临床细胞系不一样，这可能需要在动物模型上进行额外的疗效测试。

细胞系和亚细胞系检测在解决肿瘤形成的可能性时的重要性是显而易见的，因为由于多种潜在致瘤病因，移植物源性肿瘤可能在严格检测和储存的细胞系中发生。作为一种活的治疗方法，在个体的移植、传代培养或移植技术上的微小变化都有可能改变移植物的表型。此外，细胞系的典型特征是抽样较大群体的一部分，而肿瘤的形成可能是由于单个异常细胞。采用先进的技术，如环境控制的细胞培养机器人和高通量总体筛选技术，来寻求解决这些挑战。

幸运的是，美国FDA和欧洲药品管理局已经提供了监管框架，开始接近复杂的GMP细胞生产。此外，GMP设施网络，如加拿大的细胞再生医学和细胞治疗网络，已经建立，以帮助应对这些挑战。

5.4 存储和运输

在多个地点进行临床试验或治疗需要一个协调的储存和运输方法，能够适应诸如国际航运延误和意外的包裹处理条件等情况。例如，一项对人类间充质干细胞的研究发现，储存在2℃至8℃的细胞对25 Hz振动敏感，导致细胞死亡和间充质干细胞标记物(如CD29和CD44)表达的增加。同样，温度和反复冻融循环对细胞活力也有显著影响。低温保护剂的毒性、快速的渗透转移、冰晶的形成和凋亡的激活是细胞死亡过程中的关键机制。早期研究表明，人类低温保存的多能细胞存活率只有30%或更低。因此，其他冷藏技术也被开发出来，如玻璃化冷冻，在高浓度的低温保护剂中快速冷却细胞以抑制结冰。研究发现，这些措施能够提供大于75%的存活率，但增加了技术复杂性，并可能限制大规模的生产。此外，储存液(如DMSO、聚乙二醇等)和添加剂(如岩石抑制剂、海藻糖、聚-L-赖氨酸等)对储存细胞的存活和分化也有各自的作用。因此，每一种细胞类型和细胞系都需要优化，以建立一个可靠的供应链。

5.5 患者的选择

为脊髓损伤患者建立理想的细胞移植患者群体具有挑战性。考虑到目前GMP级细胞疗法的高成本和有限的可用性，一种策略是专注于有最大潜在收益的人群。颈髓损伤是最常见的，可导致日常生活活动(如进食、清理、转运)的巨大障碍，并常伴有呼吸和自主神经并发症。即使是握力和屈肘等关键肌肉群的适度改善，也能对生活质量产生深远的好处，使其成为细胞基础研究的重要人群。然而，重要的是要平衡这些包含的好处和潜在的风险。由于住院、治疗和康复费用较高，在试验中研究颈椎损伤人群的费用可能会更高。此外，将研究限制在高度特定的研究区域会使招募更具挑战性。另一个关键的考虑因素是移植时机。由于生理、损伤病因、脊髓结构、患者共病和一系列微环境细胞信号的差异，动物模型移植的最佳时机可能与人类不同。此外，即使有了既定的基础设施，也往往需要一段时间来交付储存的细胞(如异体治疗)或生成细胞系(如自体治疗)。因此，现在许多试验都是在损伤的中期到慢性阶段进行的，在这个阶段，患者的病情和神经状态相对稳定，研究招募也不那么复杂。然而，克服慢性脊髓损伤的再生障碍，如胶质瘢痕和囊性空化，可能需要一些前面讨论过的创新策略。

5.6 给药技术

适合的给药技术是转化细胞疗法的一个关键方面。使用现有完善的医疗技术进行全身或鞘内治疗避免了许多挑战，然而，细胞的分布没有得到很好的控制。对于实质内给药，越来越多地使用标准化、严格控制的输送系统，该系统必须进行计量，具备高可靠性，可以灭菌，并且作为医疗设备已获得监管部门批准。

目前使用的两种主要类型的注射器是台式系统和脊柱式系统。台式注射器提供了注射套管沿所有三个轴的高度的稳定性，但无法考量由于通气、心血管搏动或其他患者运动引起的脊髓运动。脊柱式注射系统由椎弓根螺钉固定或夹持椎弓根后椎弓，以抵消呼吸，但可能不能抵消所有的脊髓搏动。最近，一种浮动套管系统也被开发出来，它可以补偿这些自然脉动，进一步提高瞄准能力。第三类设备也在开发中，它利用安装在手术机器人上的工具，如达芬奇手术系统(Intuitive surgical Inc)，用于高度精确的定位。

6 前景

脊髓损伤的病理生理学和神经修复和再生的复杂性需要新的治疗方法。以细胞为基础修复SCI的治疗仍然是非常有吸引力和有希望的策略。随着我们对基本细胞生物学的理解加深，创新的步伐也将提速。我们预测，随着成体和多能干细胞衍生治疗的时机、剂量和给药方式的优化，越来越多的基于细胞的治疗将被用于人类。很有可能，成功的方法是多种策略的结合，如基因工程、生物材料、趋电性和疤痕消除，使临床效果最大化。正在进行的临床前和临床试验突出了该领域已取得的令人兴奋的巨大进展，并强调了全世界研究人员、临床医生、利益攸关方和资助机构正在开展的合作工作的重要性。

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