基因修饰间充质干细胞治疗脑外伤的策略

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)因其来源简单、移植后治疗效果好，已成为治疗创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)等中枢神经系统疾病和损伤的一种有吸引力的医学方法。然而，移植细胞的长期存活率和治疗效果有待提高。本文综述了近年来MSCs在临床前模型治疗脑外伤中的应用, 讨论了通过改善MSCs移植后存活率、增强其归巢能力和过表达神经保护和神经再生因子来增强其治疗TBI的能力的基因修饰方法，重点强调了使用转基因MSCs治疗脑外伤的最新临床前研究。近年来MSCs生物学的发展和潜在的治疗靶点可能会充分改进MSCs的基因修饰策略，为人类的脑外伤治疗带来有效的MSCs治疗方法。

1. 介绍

创伤性脑损伤(TBI)是最常见的头部损伤形式，由于创伤性脑损伤的多因素和异质性，在损伤后不同部位和时间点出现不同的表现，单靶点治疗并不有效。因此，一种理想的治疗策略应该是多靶点同时作用，以诱导对TBI的有效治疗。由于间充质干细胞分泌神经营养因子和其他神经保护因子，一种有希望的多靶点、同时作用的治疗选择可以是基于间充质干细胞(MSCs)的。

MSCs作为一种新兴的中枢神经系统疾病和损伤的治疗手段，如脊髓损伤、多发性硬化症、缺血性脑卒中、脑外伤等，受到人们的关注。骨髓间质干细胞被认为是很有前途的临床治疗细胞，因为它们易于分离，具有免疫抑制的特点，允许异体移植而无需免疫抑制，且无伦理争议。然而，骨髓间充质干细胞在体内的治疗效力受到其较差的生存能力、归巢能力以及损伤组织中细胞的功能的影响。生物学、分子生物学和基因工程的发展为提高MSCs治疗效能开辟了新途径。基因修饰MSCs以增强其生存、归巢和持续释放治疗因子是特别有吸引力的。

2. 搜索策略和选择标准

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3.脑外伤的神经炎症级联反应

创伤性脑损伤是一种不均匀、复杂的脑损伤，是由于机械外力的作用而发生的。机械外力可以直接(碰撞、攻击)或间接(头部突然加速-减速)传递到头部。基于细胞和组织病理学，TBI主要导致两种损伤:(1)机械外力转移到头部时发生的原发性损伤，以及(2)原发性损伤激活的继发性损伤级联。创伤性脑损伤的主要损伤发生在损伤瞬间，并导致坏死细胞的快速死亡。然而，创伤性脑损伤的继发性损伤更具破坏性，其特征是在创伤后数小时至数天内明显出现渐进性凋亡细胞死亡，并可在初次损伤后持续数周至数月。

广泛的研究阐明了相关的分子级联，支持脑外伤继发性损伤中明显的神经元功能障碍和死亡；这些包括谷氨酸兴奋性毒性、缺血、细胞内钙失调、氧化应激和神经炎症。创伤性脑损伤可导致其他脑细胞的丧失，如星形胶质细胞，这可影响这些细胞的功能和活力。越来越多的人认识到，TBI增加了几种神经退行性疾病的风险。炎症是脑外伤后继发性损伤的一个标志，它会导致神经损伤并影响神经修复机制。炎症被认为是脑外伤后继发性细胞死亡的主要原因。在最初的损伤后，损伤的轴突产生碎片，触发过度和持续的全身炎症反应，导致细胞立即死亡。受伤的细胞会释放两种促炎细胞因子，激活大脑中主要的常驻免疫细胞小胶质细胞。先前的一项研究表明，活化的小胶质细胞可在慢性创伤后第8周检测到，并与CA3细胞丢失和海马体中功能失调的细胞增殖有关。受损的血脑屏障和细胞因子释放导致外周血免疫细胞(如白细胞和巨噬细胞)的浸润和激活，这些细胞可以转化为小胶质细胞，进一步增加对TBI的免疫反应。虽然小胶质细胞可以清除细胞碎片，促进组织重塑，但炎症反应的增加，由于促炎细胞因子的过度分泌，导致白质损伤增加和细胞死亡，触发继发性损伤级联，可持续多年的损伤后。有学者研究表明创伤性脑损伤最初影响后的慢性炎症可能会在创伤性脑损伤后持续17年。这些观察结果在人类身上得到了证实，尸体组织学证据表明，在脑外伤多年后小胶质细胞激活依然存在。

4. 以MSCs为基础的TBI治疗

4.1 MSCs的生物学

间充质干细胞是一种多能的基质细胞，可分化为几种独特的间充质细胞类型。国际细胞治疗学会(International Society for Cellular Therapy)提出了以下标准来定义人类间充质干细胞：(1)体外塑料粘附;(2)表面标志物CD105、CD73、CD90阳性，CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19、HLA-DR阴性;(3)能够在标准分化条件下体外分化成成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。骨髓间充质干细胞最常用密度梯度离心法从骨髓中分离。MSCs的其他来源有脐带血(UCB)、脂肪组织或胎盘和牙髓。然而，由于来源组织微环境的不同，MSCs具有异质性，这可能赋予细胞不同的功能特性。例如，脂肪组织来源的MSCs表现出明显的表面标记CD34+、PODXL、CD36、CD49f、CD106和CD146的表达，并且与骨髓来源的MSCs相比具有更强的成脂分化能力。另一项研究检测了胎盘来源的MSCs和其他同种来源的细胞的免疫调节特性，结果表明胎盘来源的MSCs具有更强的免疫抑制作用。不同的细胞供体可能会影响细胞的特性。例如，一项研究表明，从年轻大鼠分离的MSCs中白细胞介素-1α的表达比从老年大鼠分离的细胞高8倍。

由于MSCs具有多功能的蛋白分泌组，故在脑损伤组织中具有旁分泌和自分泌活性。很少有研究表明骨髓间充质干细胞移植到脑组织后能够分化为神经元细胞。然而，在这些研究中观察到的神经获益归因于骨髓间充质干细胞的旁分泌和细胞因子作用，而不是由于骨髓间充质干细胞植入脑组织而分化为神经元细胞。因此，维持骨髓间充质干细胞在移植后较长时间的干性，使细胞在较长时间内释放旁分泌效应和营养因子，对于改善损伤脑的功能结果是至关重要的。虽然还没有临床试验报道过实验性给予MSCs的肿瘤发展，但体外和临床前模型已经报道了潜在的致瘤性、促进肿瘤生长和转移。然而，在评价MSCs致瘤性的研究中，有必要考虑实验动物的免疫状态，因为许多研究使用免疫缺陷动物模型。

MSCs的作用机制取决于其向受伤组织的归巢能力和分泌营养因子以促进内源性修复过程。MSCs最著名的分泌因子有脑源性神经营养因子(BDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(NGF)和血管内皮生长因子(VEGF)。发现MSCs释放的因子能减轻局部炎症反应，降低自由基水平，抑制细胞凋亡，促进损伤组织干细胞的血管生成、增殖和分化。

4.2 MSCs在脑外伤治疗中的应用

MSCs正在成为一个潜在的干细胞治疗创伤性脑损伤的策略，在创伤性脑损伤病人颅骨修复手术中直接移植MSCs至受伤的脑组织没有任何不良反应,表明了MSCs在临床应用治疗创伤性脑损伤的安全性。直接将MSCs移植到脑损伤组织，或通过静脉或动脉注射间接输送，可显著改善临床前模型中TBI诱导的运动和认知缺陷。累积的临床前研究表明，外周移植MSCs能够绕过血脑屏障，提高脑外伤后神经保护因子的表达。此外，脑外伤后MSCs移植表明，这些细胞可以在损伤部位迁移和存活，有助于神经保护、神经修复和运动功能。此外，MSCs分泌组可以通过降低脑组织中细胞因子的表达来调节TBI后的炎症反应。

骨髓间充质干细胞可减轻脑外伤后神经炎症，促进功能恢复。体重下降大鼠TBI模型静脉MSCs移植术后2 h可降低外周血中性粒细胞(MPO+)、CD3+淋巴细胞的浸润、巨噬细胞/小胶质细胞的活化/浸润以及促炎细胞因子。MSCs的这些抗炎作用与减少损伤组织的凋亡和早期功能改善有关。MSCs移植可以通过抑制小胶质细胞向M1促炎小胶质细胞表型的极化来改善TBI的功能结果。以MSCs为基础的治疗能够增加过度的急性促炎反应，达到清除碎片所需的水平。这种促炎反应的调控可防止慢性神经炎症的发展，促进脑外伤的神经保护。MSCs的抗炎作用是通过减少继发性损伤进一步增强MSCs治疗TBI疗效的潜在靶点，最终导致功能改善。

急性期创伤性脑损伤后海马神经再生的减少已经得到证实，海马中未成熟神经元的大量减少。多项研究表明，创伤性脑损伤还在树突发育、分枝、形态和海马神经元网络的功能整合方面损害了海马神经细胞再生。多项研究表明，创伤性脑损伤可导致海马苔藓纤维通路的轴突萌发，这与异常兴奋和创伤后癫痫发作有关。在人类，创伤性脑损伤会导致异常的轴突生长,最终导致创伤后学习和记忆障碍的影响。MSCs可促进和增强损伤组织的内源性再生。有学者发现MSCs在直接植入海马后促进内源性神经干细胞(NSCs)的增殖、迁移和分化。多项研究表明，脑外伤后MSCs移植可恢复损伤海马新生神经元树突长度的损伤。此外，MSCs分泌体促进了脑外伤小鼠内源性神经干细胞的存活和增殖。在临床前研究中，静脉注射MSCs治疗TBI的应用越来越多。尽管大多数研究表明大量的MSCS最初被困在肺中，但仍有报道称MSCs在穿过血脑屏障后到达受损大脑，改善了神经行为评分。尽管这些研究表明间充质干细胞可以穿过血脑屏障到达损伤或炎症部位，但损伤后血脑屏障的完整性受损可能会导致间充质干细胞在大脑中被动累积。

5. 基因修饰MSCs治疗脑外伤

由于损伤组织的微环境和创伤的复杂性，迫切需要开发新的策略来改善损伤部位MSCs的归巢、生存和旁分泌特性。基因修饰是一种很有前途的策略，以最大限度地发挥骨髓间充质干细胞在体内的治疗能力。虽然非病毒载体的使用正在增加，但MSCs的基因修饰通常是通过病毒载体实现的。

5.1 病毒载体介导的基因修饰

病毒载体是宿主细胞最常见和最有效的基因修饰载体，因为它们天生具有感染细胞、绕过细胞屏障和将遗传物质输送到宿主细胞核的能力。整合病毒载体，如逆转录病毒和慢病毒，是对宿主细胞进行遗传修饰的非常有效的载体，因为它们可以将感兴趣的基因导入宿主细胞基因组并将其整合。逆转录病毒只能转导较小负荷(8 kb)的分裂细胞，而慢病毒可以转导较大负荷(9 kb)的分裂和不分裂细胞。尽管整合载体在基因修饰中非常有效，但由于可能在宿主细胞中诱导插入突变和原癌基因激活引起安全问题。非整合病毒载体是不与宿主基因组整合就能感染宿主细胞的载体。腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)是最常见的用于基因修饰的非整合病毒载体，因其非致病特性、目标基因的强表达和插入突变的低风险。尽管病毒载体介导的基因修饰可能对MSCs为基础的治疗有吸引力，但病毒基因治疗的长期安全性仍有担忧。此外，转导的细胞可能呈现病毒抗原，可能在移植后的体内激活免疫反应。在这种细胞治疗可行之前，应慎重考虑收益与风险。

5.2 非病毒载体介导的基因修饰

分子生物学和基因工程的发展导致了非病毒载体的合成和设计，可以将大型遗传物质输送到细胞中。非病毒载体的优点是可以通过调控控制目标基因的表达，它们降低了免疫毒性，并且与病毒载体相比，价廉，容易大规模生产。预处理可以改善骨髓间充质干细胞在移植微环境的固有治疗特性，这在创伤性脑损伤中尤其重要。一些研究报道，预处理可以增强MSCs和先天/适应性免疫反应之间的相互作用。有学者证明缺氧条件下培养MSCs可提高细胞更多抗凋亡蛋白IL-8和IL-6的表达。其他学者也报道了类似的结果，表明缺氧条件改善了体外MSCs中的IL-10和FasL。增强免疫调节，反过来，减轻炎症，促进受伤的组织修复和再生。非病毒整合载体，如可切除系统和转座子，经常破坏宿主基因组，导致这些载体的应用有限。非整合载体，如附着体载体，与整合病毒载体相比毒性更小。尽管基于非病毒载体的基因修饰方法提供了令人兴奋的前景，但它们在治疗细胞的基因修饰中的应用可能会因目标基因的短暂表达和载体在细胞感染后的损伤而受阻。虽然非病毒基因修饰方法相比病毒基因修饰方法转染效率较低，但它能够缓解免疫原性降低的安全性问题，使其更有可能进入临床试验。

5.3 转基因间充质干细胞在脑外伤治疗中的应用

骨髓间充质干细胞的基因修饰涉及诱导对骨髓间充质干细胞治疗效果至关重要的因子的过表达。这些因子可以是增强MSCs归巢和存活的蛋白质，以及促进损伤部位恢复过程的营养因子的分泌。具有抗炎和神经保护作用的因子的过度表达是一种特别有前途的治疗创伤性脑损伤的方法。与传统的基于慢病毒或AAV载体在体内直接感染靶组织的基因治疗策略相比，基因修饰MSCs将具有更多的优势。相对的，MSCs被认为是一种更安全的基因治疗方法。此外，骨髓间充质干细胞的病毒转染可以很容易地在体外控制，并且每个骨髓间充质干细胞基因组只能有一到两个病毒载体，以遵循FDA对干细胞和基因治疗试验的规定。重要的是，基因改造可以定制骨髓间充质干细胞来治疗广泛的脑损伤，如中风和创伤性脑损伤。越来越多的证据支持在临床前模型使用基于MSCs治疗创伤性脑损伤的效率。炎症是创伤性脑损伤二次损伤的重要机制，一个很有前景的方法是使用过表达有抗炎作用的转基因MSCs治疗创伤性脑损伤。应用转基因MSCs过表达抗炎细胞因子，特别是IL-10，以减少炎症反应，已在各种损伤和疾病的临床前模型中进行了评估，包括关节炎、自身免疫性脑脊髓炎、肺缺血再灌注损伤、移植物抗宿主病和缺血性中风。最近的一项研究表明，使用转基因MSCs过表达IL-10可以通过减少炎症反应、防止细胞凋亡和组织丢失，以及减少大鼠创伤性脑损伤模型中TNF-α的产生来减轻创伤性脑损伤。IL-10的增加与TNF-α的减少相一致，促进巨噬细胞/小胶质细胞激活状态的转移，从经典的CD163激活细胞向替代的CD163激活细胞转移。

另一个通过基因修饰增强MSCs治疗潜力的有前途的策略是通过增强它们的归巢能力。骨髓间充质干细胞可以迁移到损伤部位。最近的一项研究表明，移植的间充质干细胞可在损伤部位早24小时后检测到，并可在损伤后28天存活。近年来研究表明，基因修饰MSCs是提高脑外伤中MSCs归巢能力的可行途径。例如，表达CXCR4的MSCs被强趋化性基质细胞衍生因子-1 (SDF-1)高度吸引，该因子通过星形细胞和内皮细胞在病变区显著过表达。SDF-1/CXCR4轴促进MSCs归巢到大脑和其他器官的损伤部位。有学者发现转基因MSCs过表达趋化因子受体4 (CXCR4)增强在创伤性脑损伤模型中损伤部位的聚集，旁分泌分泌细胞因子和生长因子改善，血管再生和神经保护增强，恢复轴突连接。另一个有望改善MSCs归巢的靶点是成纤维细胞生长因子21 (FGF21)，这是一种代谢调节因子，在体外表现出神经保护作用并促进细胞迁移。先前的研究表明，FGF21在体外改善了多种细胞类型的细胞迁移，包括成纤维细胞、心肌细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的迁移。然而，FGF21改善MSCs归巢的确切机制尚不清楚。

即使植入的细胞成功迁移到大脑损伤部位，它们在微环境中的神经保护功能也被发现减弱了。神经保护基因如BDNF、胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)、FGF21既能促进移植MSCs的归巢和存活，又能促进旁分泌因子诱导的修复和宿主脑损伤区域的神经保护。在一项研究中，从脐带中分离出的经基因修饰过表达BDNF的MSCs增加了迁移到脑组织并在脑组织中存活的能力，并比单独使用MSCs在创伤性脑损伤大鼠中更有效地减轻了神经功能缺损。移植过表达胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)的被间充质干细胞能够减少脑外伤大鼠海马和皮质神经元细胞损失。GLP-1是一种抗兴奋毒性的神经保护物质，具有抗氧化作用。最近，一项研究表明，移植过表达FGF21的MSCs可改善小鼠模型在创伤后慢性期的认知功能。虽然仅用MSCs治疗也有部分功能恢复，但用MSCs - FGF21治疗的功能恢复更明显。MSCs-FGF21治疗与损伤海马的神经再生增强、FGF21蛋白水平增强、未成熟神经元形态学缺陷减少有关。

积累的研究已经发现了很有前途的治疗TBI的细胞靶点，特别是那些在创伤性脑损伤的发病机制中起关键作用的细胞靶点。探索这些靶点的体外和临床前研究显示，有希望能够改善TBI导致细胞和功能损伤。例如，外源性神经保护因子如CuZn-SOD和其他神经营养因子如NGF、BDNF、FGF-2在体内外均表现出神经保护作用。它们的快速失活、对PNS的脱靶效应以及通过血脑屏障的低通透性将限制其在临床TBI中的应用。然而，这使得它们成为基于MSCs的转基因治疗的优秀候选者，这将提高MSCs的效力和治疗潜力。其他潜在的MSCs基因修饰候选miRNA如miR-195、miR-24和miR-19b，因为它们在神经元凋亡、再生和神经退行性过程中发挥作用。有研究显示脑外伤后海马和血浆miRNAs表达显著改变。MSCs通过其外泌体为miRNA提供传递系统，可以绕过血脑屏障，并通过其脂质双分子层维持miRNA的稳定性和功能。这些靶点和因子是未来有希望开发靶向性基因修饰MSCs并增强治疗TBI损伤效果的候选靶点。

转基因MSCs治疗创伤性脑损伤的风险取决于许多危险因素,其中包括基因改造的类型,插入的目标基因，其分化能力和扩散能力，MSCs的归巢能力，移植细胞的长期生存，给药途径。目前，尚无基于基因修饰MSCs治疗TBI的临床经验。基于MSCs的免疫调节特性和病毒载体介导的遗传毒性，认为与肿瘤发生相关的风险很高。相比之下，绝大多数小型临床试验都是用MSCs治疗脑外伤，或直接将病毒载体注射到人脑中，都没有报道严重的健康问题。这些临床证据表明，通过病毒或非病毒修饰方法使用转基因MSCS在临床应用是相对安全的。

6. 结论

许多研究已经概述了基于基因修饰MSCs治疗TBI的有益效果。基因修饰MSCs可增强其活力、增殖、迁移和功能特性，从而提高其治疗潜力。重要的是，基因修饰MSCs为基因治疗中的基因传递提供了一种安全、有针对性和强大的选择。如前所述，基于基因修饰的MSCs治疗可以将临床前研究转化为有效和安全的TBI靶向治疗临床应用。

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