人胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为心肌细胞的对比

心肌梗死是临床上常见的严重疾病，发病后预后不良，远期死亡率高。成熟的哺乳动物心脏再生能力有限，因此一定数量的心肌细胞发生任何明显损伤都是无法挽回的，会严重影响心室功能进而导致心衰的发生。尽管在药理学、介入治疗以及外科治疗手段等方面的进步令人振奋，但心衰病人的预后还是很差。器官移植则是目前治疗慢性心衰的唯一有效手段。近年来全球心肌梗死的发病率明显提高，临床上迫切需要更好的治疗手段。针对这个重要医学问题，用新生的心肌细胞重建损伤的心肌是一个极具吸引力的手段。干细胞领域最新的研究进展让心脏病病人看到了希望，是近年来医学研究的前沿和热点。而胚胎干细胞又是干细胞中最具发育潜能性、研究价值最高的细胞。目前体外分离和培养胚胎干细胞的实验方法已经很成熟，它们可以被大量的培养和扩增，并定向分化为心肌细胞^［1-3］。而且，胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞无论在体外还是移植到体内后都具有很强的扩增能力^［4-6］，意味着初始的亚治疗剂量的细胞可以在移植后逐渐形成具有功能意义的组织。尽管目前国内外均已具备成熟的诱导人胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的技术和方法，但是对于这两个来自不同物种但在基因水平上却高度同源的细胞系，尚缺乏它们诱导分化为心肌细胞的实验对比研究。本文对比研究体外诱导分化人胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞为心肌细胞的4种不同策略，旨在为体外胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞更为深入的研究提供实验依据。

1. 材料和方法：

1.1 材料

1.1.1 干细胞来源：

人胚胎干细胞来自于上海斯丹赛生物技术有限公司X-01干细胞系；小鼠胚胎干细胞来自于上海生命科学院R1干细胞系。

1.1.2 主要试剂：

DMEM/F12(Gibco),1%非必需氨基酸 (Gibco)，L-谷氨酰胺(Gibco),0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco), 高糖DMEM(Gibco)，青链霉素(Gibco)，丝裂霉素C(Sigma)，5%血清替代品SR(Gibco)，普通胎牛血清FBS(Gibco)，干细胞专用胎牛血清ES qualified FBS(Gibco)，成纤维细胞生长因子bFGF(Gibco)，B27无血清添加剂(Gibco)，RPMI1640培养基(Gibco)，activin A(Gibco),BMP4(Gibco)，维生素C，NaHCO₃，PBS(Gibco)，0.05%胰酶(Gibco)，明胶，基质胶(BD Pharmingen)，胶原酶Ⅳ(Gibco)，白血病抑制因子LIF(Gibco)，细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒（碧云天）。

1.1.3 主要仪器：

低速控温离心机（Thermo Scientific CL10），高速控温离心机（Thermo），液氮罐（Thermofisher），电动移液器（Thermo Scientific Finnpipette C1），CO2培养箱（Thermo，HERA cell 150i），冻存管（NUNC），50ml/ 15ml离心管（NUNC），6cm /10cm细胞培养皿（NUNC），6孔板/24孔板细胞培养皿（NUNC），低粘附性培养皿，超净台，显微镜，水浴锅。

1.2 实验方法

1.2.1 MEF的制备、复苏和培养

1.2.2 人胚胎干细胞的复苏、培养和传代

1.2.3人胚胎干细胞悬浮法制备EB以及分化

1.2.4 人胚胎干细胞加诱导剂的贴壁法分化

人

1.2.5小鼠胚胎干细胞的复苏、培养和传代

1.2.6 小鼠胚胎干细胞EB的制备以及分化

1.2.7 免疫荧光染色

1.2.8 细胞凋亡-Hoechst染色

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0统计学软件进行统计处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，统计学方法采用配对t检验及多因素方差分析，P<0.05< span="">为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 光镜下的细胞形态和免疫染色：

人胚胎干细胞克隆界限清楚，形态扁平，细胞核质比高，生长形态如鸟巢状（图一：A），细胞生长相对缓慢，传代时间大约7-9天；而小鼠胚胎干细胞克隆形态多样，相对密集，细胞核大，胞浆少，在克隆边缘有时可见少量的已分化细胞，形态为扁平上皮细胞样或梭形成纤维细胞样（图一：B），细胞生长较快，传代时间大约2-3天。悬浮法诱导形成人胚胎干细胞EB所需时间（一般4-5天）要比悬滴法诱导形成小鼠胚胎干细胞EB所需时间长（一般2-3天），但两者未贴壁前形态相似（图一：C,D），大致呈球形或椭圆形，中心呈棕黑色。EB在2-3h左右即开始贴壁，24h后完全贴壁，2天后的EB完全展开成扁平状并向外延伸生长，中间稍微突起，同时细胞形态随着分化进行也逐渐改变（图二：A,B）。分化培养7天左右，各组EB开始逐渐出现跳动的区域，此时大多数EB已经扩展到不能被一个低倍镜视野覆盖，EB内厚薄不一，有的EB能够出现多处跳动的区域，跳动区域大小不一，频率不一，幅度不一。此时人胚胎干细胞诱导分化的跳动区域的心肌细胞形态和小鼠胚胎干细胞诱导分化的跳动区域的心肌细胞形态非常相似（图二：C,D）。胚胎干细胞分化为跳动克隆后，经免疫荧光染色心肌细胞特异性标志物cTnT，可以看到几乎整个克隆都是阳性（图二：E,F）。

2.2 各组细胞诱导分化效率的比较：

2.2.1各组胚胎干细胞开始出现跳动克隆的时间比较（图三）：

每组胚胎干细胞接种96个孔，每个孔一个EB，从贴壁分化的第五天开始每天镜下观察计数。分化时间等于EB形成时间加上贴壁分化时间。统计结果，hESC不加诱导剂组出现自发跳动心肌细胞的平均时间为（13.9±0.9）天，hESC加诱导剂组出现自发跳动心肌细胞的平均时间为（13.0±1.1）天，mESC不加诱导剂组出现自发跳动心肌细胞的平均时间为（14.3±1.0）天，mESC加诱导剂组出现自发跳动心肌细胞的平均时间为（12.2±1.2）天。统计表明两种细胞系各自加诱导剂组均比不加诱导剂组出现自发跳动心肌细胞的时间提前（＊代表P<0.05< span="">，具有明显差异），但是hESC无诱导剂组和mESC无诱导剂组之间出现自发跳动心肌细胞的时间没有明显差异（P>0.05）,而mESC加诱导剂组比hESC加诱导剂组出现自发跳动心肌细胞的时间提前（P<0.05< span="">）。

2.2.2 分化过程中各组胚胎干细胞分化为跳动克隆的数量比较（图四）：

统计结果，hESC不加诱导剂组分化为跳动克隆的百分比为20.8%，hESC加诱导剂组分化为跳动克隆的百分比为66.7%，mESC不加诱导剂组分化为跳动克隆的百分比为12.5%，mESC加诱导剂组分化为跳动克隆的百分比为81.25%。统计表明两种细胞系各自加诱导剂组均比不加诱导剂组出现跳动克隆的百分比明显提高，而且小鼠胚胎干细胞系提高更多；四组细胞跳动百分比均在分化天数15-17天左右达到最高值，分化的第11-15天是克隆出现跳动的主要时间区。另外，实验表明，人胚胎干细胞诱导出现跳动的心肌细胞持续跳动的时间可以维持很长，通常能维持3个月以上，但是小鼠胚胎干细胞诱导出现跳动的心肌细胞持续跳动的时间大多只能维持10-30天。

2.2.3 各组胚胎干细胞诱导分化出现跳动EB的平均频率（图五）：

统计结果，hESC不加诱导剂组出现自发跳动心肌细胞的平均跳动频率为（63.8±5.6）次/分；hESC加诱导剂组出现自发跳动心肌细胞的平均跳动频率为（63.0±7.0）次/分；mESC不加诱导剂组出现自发跳动心肌细胞的平均跳动频率为（80.2±3.9）次/分；mESC加诱导剂组出现自发跳动心肌细胞的平均跳动频率为（79.9±7.7）次/分。统计表明，hESC不加诱导剂组比mESC不加诱导剂组心肌细胞的平均跳动频率要小（P<0.05< span="">），同样hESC加诱导剂组比mESC加诱导剂组心肌细胞的平均跳动频率也要小（P<0.05< span="">），说明种系的差异，人胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞平均跳动频率要明显低于小鼠胚胎干细胞系诱导分化的心肌细胞的平均跳动频率。

2.2.4 凋亡试剂盒检测各组心肌细胞凋亡比例（图六）：

统计结果，各组细胞经24h缺氧处理后Hoschst染色，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白（图六：A）。hESC不加诱导剂组心肌细胞凋亡比例为（8.1±0.4%）, hESC加诱导剂组心肌细胞凋亡比例为（8.0±0.5%）, mESC不加诱导剂组心肌细胞凋亡比例为（10.3±1.3%）, hESC不加诱导剂组心肌细胞凋亡比例为（10.2±0.7%）。统计表明，同一种细胞系不管加不加诱导剂，其跳动心肌细胞经缺氧凋亡刺激后，凋亡比例没有发现有显著差异（N.S.代表P>0.05,无统计学意义）。但是人胚胎干细胞系来源的心肌细胞总体水平上比小鼠胚胎干细胞系来源的心肌细胞抗缺氧凋亡能力要强，具有显著差异（图六：B）。

3.讨论

心血管疾病是人类健康的头号杀手，其中心肌梗死的发病率最高。心脏是生物体内不能再生的器官之一，心血管疾病发展到终末期，因心肌细胞结构损害导致心脏功能不可逆转性改变，健存心肌细胞的代偿能力不能满足机体需求，各种保守治疗手段亦不能从根本上解决问题，心脏移植因受心脏移植供体来源、移植物抗宿主病反应等方面的限制，给临床治疗带来困扰。寻找更有效的治疗手段，开辟新的治疗途径成为必然。随着细胞和组织工程研究的不断深入，干细胞移植技术成为治疗心血管疾病研究的热点^［7-9］。近年来随着细胞生物学尤其是干细胞生物学的飞速发展，细胞治疗在基础研究领域取得了很大的进展，目前，干细胞已经大范围的应用于心肌梗死的治疗及研究，并取得了令人振奋的初步研究成果，展示了广阔的临床应用前景。然而，细胞治疗作为一种人类多种退行性疾病新的治疗手段，确切的作用机制尚未完全阐明，临床应用的有效性和安全性依然是目前研究者们关注和争论的焦点^［10］。

研究者们一直致力于寻找这样一种体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，它耗费少，却效率高、纯度高、产量大，以符合临床应用的要求。研究表明胚胎干细胞具有很高的向心肌细胞分化的倾向^［11］。本实验中，我们对比研究用不同的方法分别诱导人胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的效率，这在国内外未见报道。人和小鼠在基因水平上高度同源^［12］，小鼠也是干细胞诱导分化为心肌细胞应用于临床之前最常用的实验移植宿主，对比研究这两种细胞系在诱导分化为心肌细胞时的异同，能够为许多这方面更加深入的研究提供基础实验依据。

人胚胎干细胞虽然生长相对小鼠胚胎干细胞要缓慢，传代时间更长，但是从诱导分化开始，到它们出现跳动心肌细胞的平均时间上，相差也就1-2天，说明不同的细胞系虽然在增殖阶段时间差异较大，但是在诱导分化为心肌细胞的时间上却相差无几。而且，尽管人胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞克隆形态以及早期贴壁分化形态差别很大，但是到分化末期，它们的克隆整体形态以及高倍镜下的心肌细胞形态都非常相似。实验表明，文中所述四种方法均能成功诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞，而且其中hESC加诱导剂activin A+BMP4的直接贴壁法在国内诱导成功尚属首次。两种细胞系各自加诱导剂组均比不加诱导剂组分化效率明显提高（心肌细胞跳动时间提前以及跳动百分比增加，P<0.05< font="">），说明了诱导剂确实促进了分化过程，但是另一方面，诱导剂大多价格昂贵，尤其是人干细胞的诱导因子，这也增加了诱导分化的费用。另外，人胚胎干细胞不加诱导剂组和小鼠胚胎干细胞不加诱导剂组在EB出现跳动的时间上没有明显差异，但是前者EB跳动百分比比后者高，说明在不加诱导剂的情况下人胚胎干细胞的三维培养模式（悬浮）比小鼠胚胎干细胞的三维培养模式（悬滴）更加有效。人胚胎干细胞系诱导分化的EB跳动频率平均值明显低于小鼠胚胎干细胞系诱导分化的EB跳动频率平均，这个符合种系的特征，但人胚胎干细胞组的EB跳动频率更加与人类的心跳速度接近，而小鼠胚胎干细胞组的EB跳动频率比小鼠的心跳相差很多，表明体外诱导分化的心肌细胞跳动频率范围比较局限，与体内心肌细胞的发育还是有很大的差别，提示我们对体内原位心肌细胞的发育过程应该有更深入的研究，才能反过来指导体外心肌细胞的分化。从实验数据分析看，小鼠胚胎干细胞在简单的维生素C诱导下就能明显提高其分化为心肌细胞的效率（达到81.25%，时间也明显加快），这个方法简单，耗费也低；但是维生素C对人胚胎干细胞分化为心肌细胞却没有明显的效果，在双重诱导因子activin A+BMP4的作用下，人胚胎干细胞的分化效率才得到了明显的提高，表明小鼠胚胎干细胞诱导分化成心肌细胞更简单快速，效率更高，而人胚胎干细胞诱导分化成心肌细胞要求更高，也更为复杂。另外，在无其他保护因子存在的情况下，人胚胎干细胞诱导的心肌细胞抗缺氧凋亡刺激能力比小鼠胚胎干细胞诱导的心肌细胞抗缺氧凋亡刺激能力明显要强，体外维持跳动的时间也明显更长，这表明从生存能力来讲，人胚胎干细胞来源的心肌细胞要比小鼠胚胎干细胞来源的心肌细胞有更高的生存能力，这为更深入的抗凋亡刺激保护因子的研究提供了基本实验数据。

成人心脏组织由有丝分裂后细胞和终末分化细胞组成，尽管也存在一小群具有类似于干细胞特征的心肌细胞^［13-14］，可是它们可利用性差，难以分离，且增殖能力受限，使得它们不能被广泛的应用于临床治疗。用胚胎干细胞诱导分化成心肌细胞的方法潜在的满足了临床修复缺血心肌所需大量心肌细胞的要求，但仍有很多问题尚未解决，主要包括：胚胎干细胞诱导分化成心肌细胞的效率还不够高^［15］；诱导分化的心肌细胞纯度不够高、杂细胞太多^［16］；心肌细胞移植后生存率低下^［17］；心肌细胞移植到宿主心肌后发生心律失常的危险性还没有确定^［18］；心肌细胞移植于受损心肌后是否能够达到电机械偶联还没有被证实^［19-20］，因而不能确定这些细胞是否直接通过增加新的动力源来提高心肌收缩功能。对原位心脏发育动态过程的研究对体外心肌细胞分化策略具有指导意义。在未来的研究中，要在胚胎干细胞分化的时间性和空间性上细致探索，因为胚胎干细胞在分化中是由很多因素综合控制的结果，每一种因素作用于一个点，因此在总体观察中不能发现它的具体作用。尽管从干细胞到临床的治疗应用还有一段很长的路要走，但是我们有理由相信，在不久的将来，经过研究者们的努力，上述的问题都会一一解决，干细胞治疗心衰的临床应用终究会变为现实。