体外光分离置换法－急性和慢性移植物抗宿主病的细胞疗法

体外光分离置换法－急性和慢性移植物抗宿主病的细胞疗法

－来自59届ASH会议的报告

李纯团翻译 朱雄鹏审校

福建医科大学附属泉州第一医院

摘要

异基因造血干细胞移植(HSCT)对许多疾病来讲是一种可能治愈的方法。虽然现用于预防和治疗急性和慢性移植物抗宿主病（GVHD）方案的疗效有了明显的提高，但它们仍明显影响移植的疗效。GVHD一线治疗方案除了糖皮质激素之外，其它治疗方案并未取得一致性。包括各种免疫抑制剂，但它们可使患者更容易合并感染和其他疾病。体外光分离置换法(ECP)是一种广泛使用的细胞治疗方法，目前被美国食品和药物管理局批准用于皮肤T细胞淋巴瘤。它通过感光剂，经紫外线去除周围循环的白细胞，然后将细胞输回给病人。可使得炎症反应转变成免疫耐受，同时没有全身免疫抑制及长时间的不良反应。因此为了制定最佳的治疗方案，有必要对a / cGVHD患者使用ECP进行大规模、前瞻性的研究。

介绍

GVHD目前仍然是异基因造血干细胞移植(HSCT)致死的主要原因之一，虽然在造血干细胞移植领域有许多新进展，对一线药物无效GVHD患者的治疗方案尚未取得学者一致认可。大约有一半的急性GVHD患者对一线方案激素无效，同时他们的死亡率非常高。另外，二线药物种类繁多，但尚无标准化，同时伴有重度骨髓抑制、器官损害、第二肿瘤及代谢异常等副反应。而且完成严密的随机对照实验还存在患者种族差异、GVHD分级（特别是慢性GVHD）及实验终点定义差别等问题。调节免疫而非直接抑制免疫功能，同时不影响移植物抗肿瘤反应，被认为是最佳的治疗方案。体外光分离置换法(ECP)被美国食品和药物管理局批准用于T细胞相关疾病包括GVHD，并用于实体器官移植后注射。虽然它被广泛使用，仍有必要对它进行规范以发挥最好的作用。

异基因造血干细胞移植术后急性移植物抗宿主病（aGVHD）的发生率因HLA差异程度、供体或受体的高龄及其他因素而异。aGVHD表现为皮疹、胃肠道症状（包括恶心、呕吐、腹痛、腹泻）及胆红素水平升高。aGVHD严重程度与死亡率相关。aGVHD的由一系列复杂的免疫反应组成，可以分为几个阶段来描述。最初，残存有能力呈现抗原的宿主细胞活化并与供体T细胞相互作用，使得后者分泌炎性细胞因子，导致供体免疫细胞的进一步聚集和活化，形成对宿主组织具细胞毒性的免疫细胞。IL - 1、脂多糖和肿瘤坏死因子- a等介质可进一步放大该反应，最终导致组织损伤和出现aGVHD临床表现。它通常发生在移植后的100天内，接受非清髓预处理的HSCT患者或已处嵌合状态的患者也可能在后期出现aGVHD。cGVHD在临床后期出现，主要累及皮肤、眼睛、肺、肝和气管等多种器官。其中HLA不匹配、aGVHD历史以及使用外周血干细胞出现cGVHD的机率高。cGVHD仍然是导致HSCT死亡的主要原因之一。最近国际血液和骨髓移植研究中心通过大规模研究表明，cGVHD的发生率随着时间增加，这可能与无关供者和外周血干细胞的使用增加有关。从急性GVHD进展到慢性GVHD患者经历最困难临床过程，需要使用免疫抑制剂数年。与aGVHD发展的一系列因果关系相比，cGVHD的相关因素更为复杂，更难以确定。cGVHD的临床表现与许多自身免疫性疾病相似，可能与小的组织相容性复合体(MHC)抗原有关。无论何种治疗方式，都必须统一评估患者的cGVHD，以便能够准确地比较患者治疗效果。美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)提供的体系目前被普遍接受。

ECP是在1980年代中期为治疗难治性皮肤T细胞淋巴瘤而发展起来的，它当时是食品和药物管理局批准的唯一应用。从那时起，该ECP设备几次更新换代，它的使用已经扩大到其他T细胞介导的疾病包括GVHD、实体器官移植后排斥预防和治疗以及自身免疫性疾病。有些应用在美国输血学会发布指南中有被提到。ECP是一种血浆分离置换程序，它通过血浆分离装置将患者的外周循环单核细胞收集，添加8 - mop，然后暴露于紫外光，最后将细胞输返回给患者。一周期大约有5%到10%外周血中循环的细胞被处理。

利用该方法治疗患者时，特别是收集细胞，需要以下参数：包括体重、体外循环最大容许体积、采集过程状态、中央静脉通道的开通、白细胞和血小板计数和胆红素水平。ECP可在一个封闭系统设备上(主要在美国使用)，或者是一个脱机程序，细胞被一个标准的细胞分离器收集并在实验室中被处理，然后输给患者，这一过程在欧洲中心更常用。后者将收集的细胞冷冻，以后再进行解冻，最后回输给患者，整个过程细胞表型没有显著变化。该方法可用于下列:长途跋涉患者，缺乏静脉通道，或者因为疾病状态不能忍受血液置换的患者。

治疗方法上的差异及和大量的参数，使得全球的临床数据难以分析。例如美国与与欧洲，在细胞收集、处理及回输给患者都有明显差别。目前还没有临床试验来确定多大量治疗细胞可达到最大的临床效果。此外，基本治疗计划和后续的治疗方法也因中心而异。一些治疗中心根据患者淋巴细胞或单核细胞计数将确定是否执行ECP。最后，虽然厂家提倡使用肝素作为主要抗凝剂，但许多中心对有较高出血风险的患者单独使用柠檬酸盐或联合肝素进行抗凝。故目前如何最佳抗凝仍有争议。然而，尽管存在这些问题，安全性和非免疫抑制机制的优点使得ECP成为异基因HSCT后aGVHD和cGVHD一种有吸引力的治疗方法。

ECP对移植物抗宿主病治疗机制

ECP对免疫系统的的作用是多方面的。首先是大家广为认可的激活淋巴细胞凋亡理论，这主要发生在治疗后的36至48小时，当DNA结合的8-MOP暴露于紫外线光后激活产生。这可能是通过上调Fas及相关的调亡信号。细胞凋亡,紧随其后的吞噬及抗原呈递，导致抗细胞炎症因子的产生和细胞炎症因子分泌的减少。在ECP治疗移植物抗宿主病过程中，多数研究表明外周循环T调节细胞(CD41 / CD251 / FoxP31)增加，该增加被证实ECP有效。通过接触致敏小鼠模型，Maeda等发现ECP抑制致敏和效应阶段，同T调节细胞通过IL– 10抑制作用类似。将T调节淋巴细胞移植到未经处理的小鼠有同样的效果。然而,ECP临床有效的主要机制不像是诱导淋巴细胞凋亡。相反,通过单个核细胞诱导树突状细胞耐受似乎更为关键。另外鼠动物实验也表明，经磁珠处理脾细胞清除T细胞对ECP疗效无改变,而损耗CD11c1单核细胞则显著降低疗效。

耶鲁大学Edelson团队通过一系列的优质的实验提示，经ECP处理过，均可导致健康的参与者和移植物抗宿主病患者单核细胞向树突状细胞转换。此外,他们证实ECP诱导几个基因的转录，该基因与单核细胞向树突状细胞转换有关。同时单核细胞，与循环淋巴细胞不同，未发现细胞凋亡。因此，单核细胞仍然可见，并有具有免疫功能，表达CD80/86。让学者特别感兴趣的是，8-MOP及随后紫外线暴露可促进亮氨酸拉链的表达，该表达可抑制树突状细胞。该团队也展示了治疗设备里单核细胞与激活的血小板相互作用的重要性。

综上所述,ECP在移植物抗宿主病的作用机制如下(图1):

•供者T细胞识别受者不相符的次要MHC

•尽管有化疗、放疗等预处理方案，受者仍有树突细胞存活，可大范围提呈自身Ⅰ类MHC抗原，并在启动GVHD过程发挥重要作用。

•单核细胞暴露于8-MOP /紫外线分化成未成熟、免疫耐受的树突状细胞，并吸收凋亡代谢产物，从而诱导耐受同种异体抗原。

•供者T细胞变得未能传递GVHD免疫反应。

图1所示。体外光分离置换法：患者血标本黄膜层被收集，将8-MOP添加到收集细胞，然后接受紫外灯光照射。单核细胞转换成不成熟、免疫耐受的DCs，然后回输给病人。活化的淋巴细胞在24至48小时凋亡。供者和残留的抗原呈递细胞清除凋亡细胞代谢产物，导致细胞因子环境有利治疗GVHD的变化：免疫耐受的DCs无法刺激效应T；调节性T淋巴细胞群增多。

ECP在HSCT的临床

在已出版文献中，有3个临床机构应用ECP于HCST中，使得病人获益：预防GVHD，治疗cGVHD 和aGVHD。只有2个评估疗效的随机临床试验发表。它们主要涉及cGVHD，具体将在本文cGVHD部分展开讨论。同时非随机试验的个案及论著被限制发表。这种限制，包括之前提到的方法的差异，导致ECP难以跟二线、三线治疗方法比较。

预防移植物抗宿主病

清髓和减低剂量预处理方案都有对ECP的应用进行研究。Miller等在2004发表他们的经验。他们在减低剂量预处理方案-7、-6天加入ECP，持续48小时喷司他丁静注，减低剂量全身照射（600cGY）以调节受者效应细胞，该方案可减少GVHD发生。GVHD预防方案也包括环孢素A及甲氨喋呤。55名恶性血液肿瘤患者入组，80%为相关供者，余为非相关供者。60%为复发难治患者，几乎所有患者均接受未刺激的骨髓。超过2级aGVHD的患者只有9%，有43%发生cGVHD同时仅有12%合并其他疾病。超过90%患者移植有效。Miller等提出在重度预处理的患者中，该方案耐受性好，非复发死亡率低下，可快速建立嵌合体，同时aGVHD 和cGVHD发生率均较低。

另一报道是使用ECP联合依那西普用于GVHD的预防。在临床试验第2阶段，48名患者入组，采减低剂量预处量，包括氟达拉滨、白消安及加或不加低剂量全身照射（200cGy）。依那西普在移植后一周2次，ECP在移植后+28天到+70天一周一次，+100天二周一次，+180天后一月一次（共12次）。其他GVHD预防药物还有他克莫司、霉酚酸酯。大部分病人是血液恶性肿瘤且HLA全相全，但有2个病人使用外周血干细胞。整个过程无移植失败，约1年后建立全供者T细胞嵌合体。虽然有57%患者发生GVHD，大部分程度较轻，但有较高的激素依赖性GVHD。

Shlomchik等报道通过诱导调节性T淋巴细胞使得受者抗原呈递细胞表达异体同种抗原可减少GVHD的发生。他们认为在清髓预处理方案前使用ECP，可调节受者抗原呈递细胞功能以减GVHD的发生。有62名血液恶性肿瘤入组，在开始预处理的4天里边续2天使用ECP，该预处理包括环磷酰胺及分级的全身照射（10-13.5Gy）。大约50%患者有全相合亲缘供者，有一例患者未全相合，其余为全相合无关供者。大约一半患者使用骨髓移植，无脐带血供者。29名患者（47%）为2次或多次复发，7名患者为难治性血液肿瘤，余26名患者为首次复发。利用国际血液骨髓移植中心里的相同预处理患者进行回顾性对照。结合提示实验组合并2到4级GVHD的风险较低，同时获得超过1年较长的总生存期。

ECP对急性GVHD的治疗

2-4级急性GVHD传统的一线治疗主要由激素组成，如泼尼松、甲泼尼松，1-2mg/kg。根据无对照实验或回顾性研究，当3-7天无效或疾病展时考虑使用二线药物，但目前尚无统一方案。利用ECP作为二线治疗方案的研究目前较少，不超过50份。但在皮肤累及的患者中，该方法总有效可达70%到100%。在Greinix等的研究中，病人数是最多的，共有59名激素耐药或依赖的患者。在初期实验（n=21）或2期临床实验（n=38）中，该患者接受2天/周ECP治疗。在2期临床实验，ECP开始的时间早于实期实验（15VS21天），在4级GVHD及累及胃肠道患者中取得较高的缓解率。这些研究均获得了较长的总生存，较低的治疗相关死亡率及较低的激素使用量。

Jagasia等对98名激素耐药的急性GVHD患者进行ECP（57名）和抗细胞因子治疗（41）进行有效率和生存期的比较，其中抗细胞因子治疗包括伊诺莫单抗和益赛普。在单因素和多因素分析中，ECP均有较高OS和有效率。因为回顾性研究，预处理方案、GVHD预防方案（包括是否移植物T细胞清除、体内清除、供者淋巴输注）均不同，可明显影响分析结果。但这些研究结果还是令人感兴趣，特别是敏感性和感染率的差异。

最后，最近有篇综述总结了9个ECP用于aGVHD的研究，包括323名激素耐药或依赖的患者，总有效率达69%。其中累及皮肤的有效率最高达84%，接下来是胃肠的有效率（65%）。鉴于其副反应小及无合并感染风险，ECP应成为aGVHD患者的治疗方法。将来应有随机对照研究来制定ECP治疗的起始时间及治疗时间。

ECP对慢性GVHD的治疗

如同急性GVHD，慢性GVHD的一线治疗药物也是激素，但约一半患者无效。同时2-3年的免疫抑制治疗增加了cGVHD的并发症及死亡率。另关于CGVHD的二线方案尚未达到一致意见。ECP经常用于对激素耐药或依赖的慢性GVHD患者，目前的报道主要是小病例和回顾性研究为主，Greinix等提出对于对激素无效的慢性GVHD患者，ECP是合适的二线治疗方案。它对皮肤、胃肠道、口腔及肝脏排异有较高的反应率，但对呼吸系统及肌肉系统同样有效。

一个多中心、随机关于ECP对难治慢性GVHD的研究已有两篇分章发表。到目前为止，这些文章是唯一随机试验的报道。第一份报道描述了治疗12周后ECP与对照组之间的比较，第二份报道则是对照组中病情进展或治疗无效而转入ECP中的研究。共有95名对激素耐药或依赖的皮肤慢性GVHD患者入组，他们被随机分配到标准免疫抑制治疗组（激素，1mg/kg.d，n=48）或标准治疗加ECP（n=47）。ECP组治疗方案如下：第1周3次，第2周-12周是一周2次。有效的患者继续一周2次，直到第24周。在第12周，对照组如病情进展或皮肤无明显改善（皮肤积分改善〈15%，或激素减量小于〈15%）可转到ECP组。本试验到第6周时，如皮肤有所改善则开始将激素减量以免影响皮肤疗效积分的计算。

最初的报道由Flowers等提供，至实验第12周时，至少50%激素减量及25%皮肤GVHD积分下降（其中ECP8.3%，对照组0%）。对照组有29名患者因治疗无效或皮肤GVHD进展转到实验组。转换因素有：任何时间点皮肤GVHD积分超过25%，在第12周皮肤积分改善〈15%或激素减量小于〈15%。在这29名患者中，90%合并大面积GVHD，大部分患者（86%）完成了24周ECP治疗。共有9名患者取得完全或部分缓解，皮肤积分下降中位数为第12周-8，第24周-25。在第24周时，约30%患者激素减量率超过25%。这些报道很重要的一点就是提到了ECP可减少激素的用量，同时随机试验也是可行。

结论

虽然目前发表的文献支持ECP对GVHD的预防及对激素耐药或依赖的慢性GVHD患者的治疗，仍需要进一步研究取得重大进展。关于ECP作用机理已取得重大突破,这将有助于指导未来在这个领域的研究。例如,如果单核细胞与血不板之间的相互作用对诱导耐受的树突细胞至关重要,那么提高血小板数量是否要使将患者受益于治疗?哪些变量可以个体化以提高治疗效?其中ECP是否在封备设备实行也非常重要，白细胞总数、绝对淋巴细胞计数、起始时间、治疗日程表、维持时间等不同使各个试验难以比较。此外,导致无法确定性如何最好地使用这种疗法。目前，已有研究正在确定可以预测治疗反应的生物标记，同时严格的反应标准正在制定，这者将有助于ECP治疗进一步规范及提高。多个关于ECP在儿童和成人患者移植物抗宿主病治疗的报道已经出版，与其他可用免疫抑制疗法相比整体良好的安全性持续使这种疗法有吸引力,尽管还在很多不明确的因素。对ECP在同种异体HSCT领域合理使用的制定，临床试验是必不可少的。关于单倍体移植GVHD的预防及与一线药物联合的研究也应进一步进行。