华西医院小儿外科吉毅团队——通过斑马鱼探索西罗莫司和依维莫司对儿童生长发育的影响

近期，四川大学华西医院小儿外科吉毅教授团队在基础研究领域的高质量期刊Biomedicine ＆ Pharmacotherapy发表研究型论文“Toxic effects of sirolimus and everolimus on the development and behavior of zebrafish embryos”，通过斑马鱼动物模型探索西罗莫司和依维莫司这两种药物对儿童生长发育的影响。该文第一作者为四川大学华西医院小儿外科博士研究生张梓欣和博士研究生邱桐，通信作者为吉毅教授。

哺乳动物雷帕霉素靶点抑制剂作为一类免疫抑制剂（包括西罗莫司和依维莫司），逐渐被发现具有更多的功能，并且目前已经广泛应用于儿童这一群体。在许多缺乏特异性治疗方法的儿童疾病，特别是脉管异常，表现出独特的治疗效果。研究证实，对于复杂的血管畸形，超过80%的患者使用西罗莫司后症状有所好转。即使是死亡率较高的卡波西样血管内皮瘤以及卡波西样淋巴管瘤病，也有大量患者对西罗莫司和依维莫司有反应。尽管许多高质量的研究证实西罗莫司和依维莫司使用在儿童身上是安全有效的，但是目前美国食品药品监督管理局（FDA）尚未批准西罗莫司用于13岁以下儿童，也有许多家长十分关心这类药物是否会影响儿童的生长发育。因此，进行一项关于西罗莫司和依维莫司对儿童生长发育影响的研究是非常必要的。

本研究选择了斑马鱼这一动物模型，因为斑马鱼培育周期短、产量高且价格便宜，其胚胎全身透明，因此可以在显微镜下直接观察到体内各器官的生长发育情况，是最适合本研究的动物模型。在受精后3小时，我们在胚胎培养的环境中加入不同浓度的西罗莫司和依维莫司，然后每24小时使用显微镜记录胚胎的存活情况和形态，我们关注的胚胎形态特征包括尾部脱离、体节形成、心跳、色素沉着、心包水肿以及各部位发育畸形。在受精后5天时，用特殊的运动跟踪仪器跟踪斑马鱼幼鱼的运动，然后用软件记录并分析幼鱼的运动频率、总运动距离、平均运动速度、最大运动速度等各种运动相关数据。针对不同器官系统的发育，我们选择特定荧光标记的转基因鱼，可以在荧光显微镜下，通过荧光的数量和强弱来直接观察该器官系统的发育情况。

我们发现西罗莫司和依维莫司对斑马鱼胚胎的致死浓度都在15μM左右，在浓度为0.5 μM时会减慢胚胎的孵化率。当浓度低于10μM时，胚胎形态基本正常，一旦浓度高于10μM ，胚胎的畸形率显著升高，并且随着药物暴露时间的增加，畸形率也增加。最常见的畸形是体轴弯曲和心包水肿。在观察过程中，我们还发现胚胎接触药物后体长会明显缩短，因此，我们对受精后3天、4天和5天的体长进行了详细的统计分析，发现浓度大于0.5μM时会导致体长显著缩短，随着浓度和暴露时间的增加，实验组和对照组之间的差异也增加。但是对比西罗莫司和依维莫司两个药物之间的差异没有统计学意义。

对于运动的影响，我们观察了光环境和暗环境这两个环境下，我们发现胚胎在暗环境下的运动要明显活跃于光环境下，并且给予西罗莫司或依维莫司干预后，胚胎的运动明显减缓，浓度为0.5μM时与未干预组相比就有显著的差异。对于神经系统的发育，我们统计了运动神经元轴突的长度以及中枢神经系统的荧光强度，发现在受精后24小时，浓度大于或等于0.5 μM时，轴突显著缩短荧光强度也会明显降低；在受精后48小时，轴突和荧光强度与未干预组之间的差异有所缩小，但仍存在。对于血管的发育，我们也观察了受精后24小时和受精后48小时这两个时间点，发现受精后24小时的胚胎的大血管都发育良好，但是与未干预组相比，药物干预组的背侧节间血管吻合支的发育迟缓，在受精后48小时才出现吻合。对于免疫系统的发育，我们观察了中性粒细胞和巨噬细胞这两个代表了先天免疫系统的重要细胞的发育，发现药物干预浓度大于0.5μM时，中性粒细胞和巨噬细胞的标记显著减小，并且药物浓度越高，对免疫系统的影响越大。

图 1 西罗莫司和依维莫司对神经系统发育的影响

图 2 西罗莫司和依维莫司对血管发育的影响

从以上可以得出结论，当西罗莫司和依维莫司浓度超过0.5μM时，会显著减缓斑马鱼胚胎的生长发育，运动、神经、血管、免疫系统等都会受到影响，但是只要浓度小于0.1μM，斑马鱼胚胎的生长发育就趋于正常。因此，患儿在口服西罗莫司或依维莫司治疗时，一定要严格监测血药浓度，定期随访，根据血药浓度调整药物剂量，保证患儿的生长发育不会受到药物影响。