95例急性淋巴细胞白血病患者随访及复发、生存分析

摘要

在成人急性淋巴细胞白血病(ALL)中，移植后复发是异基因造血干细胞移植后死亡的主要危险因素。我们于2016年2月至2021年6月在郑州大学第一附属医院开展了一项回顾性队列研究，以确定接受异基因造血干细胞移植的ALL患者的复发风险，并研究地西他滨(dec)的疗效。对95例连续的ALL患者进行分析，根据移植后是否使用地西他滨分为dec组和对照组。dec组3年累计复发发生率低于对照组(20.8% vs 46.5%)。dec组3年总生存期和无病生存期分别为81.1%和74.8%，显著优于对照组总生存期和无病生存期(52.7%和49.4%)。此外，对T-ALL/淋巴母细胞淋巴瘤(LBL)患者的亚组分析显示，dec组的3年CIR、OS和DFS率分别为13.4%、89.2%和81.1%，显著优于ctrl组的3年CIR、OS和DFS率分别为43.7%、56.7%和51.6%。同样，Ph-阴性B-ALL/LBL患者dec组3年CIR、OS和DFS分别为19.3%、83.5%和75.9%，显著优于ctrl组的52.1%、40.2%和41.7%。总之，所有患者，特别是那些T-ALL/LBL和Ph阴性的B-ALL/LBL，可以受益于地西他滨作为异体造血干细胞移植后的维持治疗。

前言

成人急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种起源于B或T淋巴细胞的恶性肿瘤，约占所有急性白血病的15%-20%。尽管ALL患者从异基因造血干细胞移植中获益良多，但复发仍然是异基因造血干细胞移植后患者最常见的死亡原因。在移植后复发的患者中，1年和2年总生存率(OS)分别仅为17%和10%。供者淋巴细胞输注(DLI)是目前移植后复发最常见的治疗方法。然而，无论疾病类型和供体细胞来源如何，DLI后的预后仍然很差。同样，在使用CD19或CD22嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗的临床试验中，难治性或复发性B急性淋巴细胞白血病患者显示70%-90%的完全缓解(CR)率;然而，这些患者中有相当一部分会在1年内复发。因此，预防ALL患者异体造血干细胞移植后白血病复发仍然是重中之重。

既往研究表明，急性髓系白血病(AML)移植后复发与可能影响免疫功能的通路失调有关，包括通过表观遗传学沉默下调主要组织相容性复合体(MHC) II类基因，使白血病细胞逃脱移植物抗白血病效应，MHC II类基因表达下调是II类转激活因子(CIITA，MHC-II类分子基因转录的主要调控因子)高甲基化的结果。HLA-II类分子在大多数急性早幼粒细胞白血病和部分AML中不表达[8]。大多数T-ALL患者会出现HLA-II类分子表达缺失[9],仅有5%~17%的T-ALL表达HLA-DR[10]。在T细胞白血病细胞株及原代细胞中，启动子CIITA的过甲基化导致的HLA-II表达下调可能是白血病细胞免疫逃逸的机制之一[10]。同样，B-ALL的DNA甲基化模式已被广泛研究与生存的关系，在几项研究中，恶性细胞的甲基化水平高于正常造血前体B细胞和来自同一患者的缓解样本。因此，CIITA（MHC-II类分子基因转录的主要调控因子）启动子的去甲基化是增强HLA-II表达和移植后GVL效应的一种很有前途的方法。Trino等[12]对AML、ALL、霍奇金淋巴瘤移植后患者进行1年内DNA甲基化动态测序发现，与完全嵌合者相比，混合嵌合者骨髓造血干祖细胞的甲基化程度更高，提示造血干祖细胞的甲基化状态可作为移植后复发的预测指标。根据上述研究，去甲基化(hypomethylating agents, HMAs)可用于移植后ALL的治疗。

去甲基化药物地西他滨(dec)是一种已获批准的治疗急性髓系白血病、慢粒单核细胞白血病和高危骨髓增生异常综合征的药物。近期研究发现，去甲基化治疗预防异基因HSCT后AML复发主要涉及增加T调节(Treg)细胞数量和诱导细胞毒性CD8+ T细胞对肿瘤的反应。因此，我们首先进行了一项回顾性研究，以探讨dec在ALL/淋巴母细胞淋巴瘤(LBL)患者接受同种异体造血干细胞移植(allo-HSCT)作为预防复发策略的有效性和安全性。

方法

病例

纳入2016年1月至2021年6月在郑州大学附属第一医院接受异基因造血干细胞移植的连续95例ALL患者(图1)。ALL或LBL的诊断标准基于who 2016年指南，纳入标准如下:(1)年龄≥14岁;(2)维持治疗前形态完全缓解(CR)。

排除标准包括:(1)无法控制的真菌、细菌或病毒感染;2)活动期移植物抗宿主病(GVHD);(3)严重骨髓抑制;(4)多器官功能衰竭;(5)血液学复发。

本研究经郑州大学附属第一医院伦理委员会(编号SS-2018-42)批准，所有患者在治疗前均根据《赫尔辛基宣言》给予书面知情同意。

预处理及维持治疗方案

所有患者接受改良的白舒非(Bu)/环磷酰胺(Cy)或全身照射(TBI)/C的预处理方案。 (HLA)无关供者(URD)和HLA单倍体供者(HID)均接受兔抗胸腺细胞球蛋白(ATG)治疗。改良后的Bu/Cy如下:对于HLA-HID人群，阿糖胞苷(Ara-c)在-10和-9天以4 g/m2/d静脉注射，Bu (3.2 mg/kg/d -8至-6天)，Cy (1.8 g/m2/d -5至-4天)和司莫司汀 (250 mg/m2/d -3天)。对于HLA-URD和HLA -同胞兄弟供体(ISD)，Ara-c在第-10天和-9天以2 g/m2/每天。根据上述基本方案，部分患者会使用氟达拉滨(30mg /m2/d，连续5天，-10 ~ -6)。相应的，TBI/Cy如下:第-8和-7天TBI共9 Gy，第-4和-3天Cy总剂量3.6g/m2，有或没有依托泊苷(VP16，第-6和-5天10 mg/kg)。在HLA单倍或无血缘关系供体移植中，从第-5天到-2天使用7.5-10 mg/kg的ATG(作为总剂量)加入预处理方案。

地西他滨，剂量为10 mg，如果最小残留病(MRD)至少连续两次试验阴性，则连续每个月给药3天，预计8个周期。对于活动性移植物抗宿主病、中性粒细胞减少症或其他疾病相关问题的患者，维持治疗可能会被推迟。如果患者在维持治疗的最后阶段MRD检测转为阳性，根据医生和患者的要求增加周期数，并根据患者的血象恢复情况延长每个周期的间隔时间。

GVHD预防

亲缘供体移植采用环孢素A (CsA)联合短程甲氨蝶呤(MTX)，无关和单倍体供体移植采用CsA、短程甲氨蝶呤(MTX)、霉酚酸酯(MMF)和ATG。CsA (3mg /kg/day)连续输注24小时，从第-9天开始，浓度调整到150-250 ng/ml。当移植后病人的肠道功能恢复正常时，我们改用口服给药。从-9天开始，每8或12小时口服0.5 g MMF，减少到一半剂量，直到移植后第28天，最后在+60天内停止。第+1天(15mg /m2)、+3天、+6天和+11天(10mg /m2)，给予短疗程MTX。由于这些患者具有较高的ALL复发风险，如果没有发生GVHD，两组患者在移植后100天内逐渐减少免疫抑制药物并终止使用

参数评估

根据NCCN指南或国际预后指数(IPI)评分评估ALL或LBL的危险分层。ALL的CR定义为外周血无原始细胞和髓外无病变。LBL的CR定义为PET/CT无阳性发现，BM正常。白血病相关的异常免疫表型被定义为:在BM中FCM ＞0.01%或在ph -阳性/ ph -样ALL患者中BCR-ABL/BCR-ABL样转录水平＞0%。急性移植物抗宿主病(aGVHD)和慢性移植物抗宿主病(cGVHD)均采用统一标准进行评估。根据血常规变化评估治疗后的血液毒性，并使用美国国家癌症研究所通用毒性标准4.0版本进行分级。

统计分析

主要终点是累计复发发生率(CIR)、总生存期(OS)和无病生存期(DFS)。地西他滨治疗后移植物抗宿主病的发生率和地西他滨维持方案的安全性是次要目标。卡方检验或Fisher精确检验被用来比较两个队列之间的分类参数。连续参数比较采用Mann-Whitney U检验。采用竞争风险模型计算CIR、非复发死亡率(NRM)和95% 置信区间复发的HR。采用Kaplan-Meier法估计OS和DFS，并采用log-rank检验进行比较。假定值P＞0.05为有统计学意义。采用SPSS(26.0版本)和R软件包(4.2.0版本)进行统计分析。

结果

患者特征

最终纳入95例ALL患者。患者特征见表1。男性66例(69.5%)，女性29例(30.5%)。全部人口的中位年龄为24(14-55)岁。标危9例(9.5%)，高危86例(90.5%)。B-ALL/LBL平均55例(57.9%)，T-ALL/LBL平均40例(42.1%)。费城染色体阳性(Ph-阳性或Ph+) 18例(18.9%)，阴性(Ph-阴性或Ph-) 77例(81.1%)。除预处理方案外，两组患者的基线特征无显著差异。所有患者都接受了清髓预处理方案并成功植入了中性粒细胞和血小板，71例(74.7%)患者接受了基于Bu/ cy的预处理方案，其中6例患者同时接受了氟达拉滨。其余24例(25.3%)给予TBI/cy为基础的移植方案，其中13例接受VP16。为了明确两组不同的预处理方案对患者生存的影响，我们进行了亚组分析，发现无论患者接受何种预处理方案，接受dec维持治疗的患者有更长的OS和DFS(补充图1)。

地西他滨组维持治疗情况

表2和图2 - 3说明了在此期间地西他滨维持治疗的结果。在所有患者中，从移植到开始维持治疗的中位时间为88(51-175)天，中位地西他滨周期为8(1-14)疗程。32例患者(69.6%)在研究结束时完成了预期的8个周期的治疗。值得一提的是，在8个周期的维持治疗后，有2例患者(No. 11和No. 12) MRD转为阳性，分别要求再治疗5个周期和6个周期，在继续治疗1个周期地西他滨后MRD转为阴性。7例患者在维持治疗期间复发，3例患者在结束维持治疗后复发。6例ph阳性ALL患者在移植后维持期同时给予TKI口服。

复发率，非复发死亡率，生存率，无疾病进展生存率

中位随访时间dec组为36.1个月(5.1 ~ 72.1个月)，ctrl组为25.6个月(3.8 ~ 64.2个月)。估计dec组的3年累积复发率为20.8% (95%CI: 9.1%-32.5%)，而ctrl组为46.5% (95%CI: 32.5%-60.5%) (p = 0.012，图4)。46例dec组患者中有10例(21.7%)复发，中位复发时间为12.2个月(范围，5.2-53.6个月)。血液学复发6例(13.0%)，髓外复发4例(8.7%)。ctrl组22例(44.9%)患者复发，中位复发时间为6.3个月(1.9 ~ 28.3个月)，其中17例(34.7%)为血液学复发，5例(10.2%)为髓外复发。

至随访结束，dec组38例(82.6%)、ctrl组27例(55.1%)患者仍存活。其中，两组各有1例患者在首次移植后出现血液学复发，经CAR-T细胞免疫治疗桥接第2次移植后存活。dec组和ctrl组的3年TRM累积发生率分别为4.4% (95%CI: 0.53%-15.5%)和4.1% (95%CI: 0.50%-14.5%， p = 0.94)。包括严重感染3例，严重GVHD 1例。dec组3年OS率和DFS率分别为81.1% (95%CI: 69.9% ~ 94.0%)和74.8%(62.8% ~ 89.0%)，均显著高于ctrl组的52.7% (95%CI: 39.8% ~ 69.8%) (p = 0.0035;49.4%， [95%CI: 36.8% ~ 66.3%]， p = 0.014)。

亚组分析

根据不同疾病亚型进行亚组分析。在T-ALL/LBL患者中，dec组的3年累积复发率低于ctrl组(13.4% [95%CI: 1.1%-40.8%]对43.7% [95%CI: 22.5%-64.9%]， p = 0.03，图5)。dec组和ctrl组的3年DFS率分别为81.1% (95%CI: 63.4%-100%)和51.6% (95%CI: 33.9%-78.5%)。dec组和ctrl组的3年OS率分别为89.2% (95%CI: 76.0% ~ 100%)和56.7% (95%CI: 38.9% ~ 82.7%)。同样，我们在B-ALL/LBL分析中考虑了移植后ph阳性患者口服TKI因素的影响;因此，仅分析ph阴性B-ALL/LBL患者。dec组和ctrl组ph阴性B-ALL/LBL患者的3年累积复发率分别为19.3% (95%CI: 2.4%-36.18%)和52.1% (95%CI: 27.6%-76.6%) (p = 0.055，图6)。dec组的3年OS和DFS分别为83.5% (95%CI: 67.9%-100%)和75.9% (95%CI: 59.5%-96.8%)，均显著高于ctrl组的相应值(40.2%，[95%CI: 19.1%-84.7%]， p = 0.011;41.7% (95% ci: 22.7% - -76.4%),分别为p = 0.043)。

GVHD和血液学毒性

aGVHD和cGVHD的发生率见表3。dec组与ctrl组的aGVHD和cGVHD发生率差异无统计学意义(19.6%对16.3%，p = 0.464;28.3% vs 30.6%，p = 0.421)。白细胞减少是维持治疗期间最常见的血液学不良事件。及时给予G-CSF治疗，几乎所有患者的白细胞计数均可恢复。在骨髓抑制期间没有患者需要输血。仅1例患者因粒细胞减少引起的肺部真菌感染而停止维持治疗。

单因素和多因素分析

采用竞争风险模型(Fine和Gray模型)确定复发风险比及其95%CI;采用Cox回归模型，通过单变量模型初步评估协变量，并在多变量模型中调整可能的混杂因素，确定影响OS和DFS的变量。结果示于表4中。我们发现，维持治疗、复发/难治和移植前MRD状态是复发、DFS和OS的独立影响因素(详见补充数据)。此外，在移植前处于CR、MRD+或NR状态的患者中，dec组和ctrl组在移植后3年的复发率有显著差异(25.9% [95%CI: 1.1%-50.7%] vs. 81.8% [95%CI: 23.2%-97.3%]， p = 0.02)。在CR患者中，与ctrl组相比，MRD- dec维持治疗有降低移植后3年累积复发率的倾向[18.9% (95%CI: 5.7% ~ 32.0%)对35.2% (95%CI: 20.0% ~ 50.4%)， p = 0.09]。

讨论

尽管成人ALL的allo-HSCT的效果有了很大的进展，但移植后复发并没有多少改善。DNA甲基化的异常在成人ALL中较为常见，且在ALL中也经常发生TP53过甲基化、而不是TP53突变[22]。已有不少研究表明抑癌基因的甲基化程度与ALL的亚型和预后密切相关[23]。在之前的研究中，地西他滨已被用于移植后的AML/MDS患者的维持或挽救治疗。在成人T-ALL中，与DNA甲基化模式相关的基因常发生改变。这些针对淋巴祖细胞的表观遗传改变可能是白血病前转化的第一步，而且根据其进一步的遗传打击，这种白血病前克隆可能最终在特定谱系中向白血病完全转化。与正常胸腺T细胞比较, T-ALL甲基化程度明显提高[27]。在人T细胞白血病-淋巴瘤病毒-1（HTLV-1）感染的T细胞中发现了22个因高甲基化而下调的基因，负向调控T细胞受体的信号转导，其利于HTLV-1感染细胞优势生长，在T-ALL的发生中具有重要作用[28]。在HTLV-1感染细胞的小鼠异种移植模型中，地西他滨可抑制其生长[28]。有报道称T-ALL中存在CpG岛甲基化表型，并且该高甲基化谱与不良预后相关[29]。Van der Meulen等[30]也认为逆转DNA高甲基化状态可能是治疗T-ALL的好方法。追踪全基因组CpG甲基化的4种分类可监测成人T-ALL的残留、预测复发并指导治疗[31]。

T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)常与前期治疗反应差或诱导治疗失败有关。尽管造血干细胞移植(HSCT)是治疗高危T-ALL的首选方法，但原发性耐药白血病的临床预后仍然很差，总生存率约为20%。Zhang等在体外实验中发现，地西他滨通过将细胞周期阻滞在G2期、抑制细胞增殖和诱导molt4细胞凋亡对人T-ALL细胞系产生影响。虽然临床前研究表明，使用去甲基化药物可使T-ALL发生去甲基化，但支持使用HMAs单药治疗T-ALL的证据有限。这些临床病例中的大多数通常联合额外治疗复发/难治性T-ALL或ETP-ALL（ETP-ALL是一种由早期祖细胞和髓系标志物组成的独特免疫类型的T-ALL）。在我们的研究中，dec治疗在预防T-ALL复发方面显示出显著的效果，19例T-ALL/LBL患者中，dec组的3年CIR率为13.4%，而ctrl组为43.7%。令人惊讶的是，dec组仅有2例患者复发，包括1例ETP-ALL患者。ETP-ALL患者维持治疗后虽出现髓外复发，但DFS超过28个月，令人鼓舞。

在B-ALL中，某些在血液系统恶性肿瘤中发挥重要作用的基因启动子区甲基化模式发生改变。这些抑癌基因包括CDKN2B (p15)、CDKN1C (p57)、DLC1和jak - stat负调控因子PTPN6，它们的启动子发生异常高甲基化，从而阻断白血病细胞的凋亡能力。DNA高甲基化在血液系统恶性肿瘤(包括B-ALL)的基因调控中起关键作用。Bhatla等发现，地西他滨可使儿童B-ALL复发时被选择性甲基化和沉默的基因重新表达。同样，Burke等人也从他们的研究中得出了一致的结论，即复发患者接受地西他滨和伏立诺他治疗后应答良好。在他们的进一步研究中，他们研究了表观遗传治疗是否可以改变CD19的表达。尽管样本量小，但他们确实观察到地西他滨和伏立诺他治疗后CD19表达上调，并伴有CD19启动子甲基化降低的证据。尽管这只是一个初步发现，但它确实意味着(特别是在CD19启动子明显甲基化的情况下)表观遗传疗法可能能够使白血病细胞对CD19靶向免疫疗法更敏感。值得注意的是，1例患者在3个周期地西他滨维持治疗后出现骨髓复发，接受CD19靶向CAR T细胞治疗作为桥接治疗和二次移植。该患者目前状况良好。虽然我们无法确定地西他滨是否确实增强了CAR T细胞区分B-ALL肿瘤细胞的能力，但我们有必要详细了解表观遗传调控如何影响内源性T细胞和输入的CAR T细胞。

Cui等报道了地西他滨单独或联合化疗和DLI治疗12例移植后复发的ALL患者，并发现Ph阳性ALL患者的生存率高于Ph阴性ALL患者。然而，在我们之前的研究中，尽管所有Ph阳性患者在dec维持治疗期间也接受口服TKI，但对Ph阳性患者的dec维持治疗并无显著效果。因此，与地西他滨相比，将下一代TKI作为Ph阳性ALL患者的治疗选择可能更有益。基于我们之前的研究，我们还在两个队列中探索了Ph阴性患者。两组3年CIR差异存在边界阳性;而dec组中Ph阴性患者的OS率和DFS率均显著高于ctrl组。Hoshino等观察到，44例Ph阴性ALL患者中有9例(20%)检测到Hck甲基化，16例Ph阳性ALL患者中有1例(6%)检测到Hck甲基化，将细胞暴露于去甲基化药物可逆转异常的Hck甲基化，这提示地西他滨可能对ALL有治疗作用。我们的结果也证实了地西他滨对ph阴性ALL的临床活性。

Gao等发现，HR-AML患者allo-HSCT后接受G-CSF联合dec维持方案治疗时，cGVHD发生率未增加。第2周期治疗后，淋巴细胞亚群分析显示Treg细胞比例显著升高，可抑制GVHD，但不降低GVL效应。他们的研究还表明，小剂量地西他滨维持治疗的耐受性良好，并且有中度血液学毒性。本研究中仅4例(8.7%)患者出现3 ~ 4级中性粒细胞减少，且几乎所有患者的白细胞计数均可在G-CSF治疗后恢复。仅1例患者因粒细胞减少引起的肺部真菌感染终止维持治疗。

在研究局限性方面，首先，本研究为单中心、回顾性研究;其次，由于样本量有限，部分亚组的检验效能可能不足。此外，患者的选择可能使结果产生偏倚。

总之，地西他滨作为成人ALL患者allo-HSCT后的维持治疗方案可显著降低复发，改善OS和DFS。尤其是这种维持治疗可使Ph阴性B-ALL和T-ALL获益。此外，dec治疗可显著降低移植前完全缓解、MRD阳性患者的复发率，证明前者可克服移植前MRD阳性患者的不良预后效果。我们需要更大规模、更长期随访的前瞻性临床试验来确定dec维持治疗的疗效和安全性。